Al Alzheimer-malsano (AD) mankas proteinbiosignoj kiuj reflektas ĝian multoblan subestan patofiziologion, malhelpante la progreson de diagnozo kaj terapio. Ĉi tie, ni uzas ampleksan proteomikon por identigi biosignojn de cerbospina fluido (CSF), kiuj reprezentas larĝan gamon de AD-patofiziologio. Multeksa mas-spektrometrio identigis proksimume 3,500 kaj proksimume 12,000 proteinojn en AD CSF kaj la cerbo, respektive. La reta analizo de la cerba proteomo solvis 44 biodiversecmodulojn, 15 el kiuj interkovris kun la cerbo-spina likva proteomo. La CSF AD-signoj en tiuj imbrikitaj moduloj estas falditaj en kvin proteingrupojn, reprezentante malsamajn patofiziologiajn procesojn. La sinapsoj kaj metabolitoj en la AD-cerbo malpliiĝas, sed la CSF pliiĝas, dum la glial-riĉa mjelinigo kaj imungrupoj en la cerbo kaj CSF pliiĝas. La konsistenco kaj malsanspecifo de la panelŝanĝoj estis konfirmitaj en pli ol 500 pliaj CSF-provaĵoj. Tiuj grupoj ankaŭ identigis biologiajn subgrupojn en sensimptoma AD. Ĝenerale, ĉi tiuj rezultoj estas promesplena paŝo al ret-bazitaj biomarkaj iloj por klinikaj aplikoj en AD.
Alzheimer-malsano (AD) estas la plej ofta kaŭzo de neŭrodegenera demenco tutmonde kaj estas karakterizita per larĝa gamo de biologiaj sistemaj misfunkcioj, inkluzive de sinapta dissendo, glial-mediata imuneco kaj mitokondria metabolo (1-3). Tamen, ĝiaj establitaj proteinbiosignoj daŭre temigas detektado de amiloido kaj tau-proteino, kaj tial ne povas reflekti tiun varian patofiziologion. Ĉi tiuj "kernaj" protein-biomarkoj kiuj estas plej fidinde mezuritaj en cerbo-spina likvaĵo (CSF) inkluzivas (i) amiloida beta-peptido 1-42 (Aβ1-42), kiu reflektas la formadon de kortikalaj amiloidaj plakoj; (ii) totala tau, signo de aksondegenero; (iii) fosfo-tau (p-tau), reprezentanto de patologia tau-hiperfosforiligo (4-7). Kvankam ĉi tiuj cerbo-spinaj fluidaj biomarkiloj multe faciligis nian detekton de "markitaj" AD-proteinaj malsanoj (4-7), ili nur reprezentas malgrandan parton de la kompleksa biologio malantaŭ la malsano.
La manko de patofiziologia diverseco de AD-biosignoj kaŭzis multajn defiojn, inkluzive de (i) la malkapablo identigi kaj kvantigi la biologian heterogenecon de AD-pacientoj, (ii) nesufiĉa mezurado de malsangraveco kaj progresado, precipe en la antaŭklinika stadio, Kaj ( iii) la disvolviĝo de terapiaj drogoj, kiuj ne sukcesis tute solvi ĉiujn aspektojn de neŭrologia difekto. Nia dependeco de grava patologio por priskribi AD de rilataj malsanoj nur pligravigas ĉi tiujn problemojn. Pli kaj pli da evidentecoj montras, ke la plej multaj maljunuloj kun demenco havas pli ol unu patologian karakterizaĵon de kogna malkresko (8). Eĉ 90% aŭ pli de individuoj kun AD-patologio ankaŭ havas vaskulajn malsanojn, TDP-43-inkludojn aŭ aliajn degenerajn malsanojn (9). Ĉi tiuj altaj proporcioj de patologia interkovro interrompis nian nunan diagnozan kadron por demenco, kaj necesas pli ampleksa patofiziologia difino de la malsano.
Konsiderante la urĝan bezonon de diversaj AD-biosignoj, la kampo ĉiam pli adoptas la "omikan" metodon bazitan sur la ĝenerala sistemo por malkovri biosignojn. La Akcelita Farmacia Partnereco (AMP)-AD-Alianco estis lanĉita en 2014 kaj estas ĉe la avangardo de la programo. Ĉi tiu multfaka klopodo de la Naciaj Institutoj de Sano, akademio kaj industrio celas uzi sistem-bazitajn strategiojn por pli bone difini la patofiziologion de AD kaj evoluigi biodiversecan diagnozan analizon kaj kuracajn strategiojn (10). Kiel parto de tiu projekto, retproteomiko fariĝis promesplena ilo por la akcelo de sistem-bazitaj biosignoj en AD. Ĉi tiu senantaŭjuĝa datuma aliro organizas kompleksajn proteomikajn datenojn en grupojn aŭ "modulojn" de kunesprimitaj proteinoj, kiuj estas asociitaj kun specifaj ĉeltipoj, organetoj kaj biologiaj funkcioj (11-13). Preskaŭ 12 informriĉaj retproteomikaj studoj estis faritaj sur la AD-cerbo (13-23). Ĝenerale, ĉi tiuj analizoj indikas, ke la AD-cerba reto-proteomo konservas tre konservitan modulan organizon en sendependaj kohortoj kaj multoblaj kortikalaj regionoj. Krome, kelkaj el tiuj moduloj montras reprodukteblajn ŝanĝojn en AD-rilata abundo trans datumserioj, reflektante la patofiziologion de multoblaj malsanoj. Kolektive, tiuj trovoj montras esperigan ankropunkton por la eltrovo de la cerba retoproteomo kiel sistem-bazita biosigno en AD.
Por transformi la AD-cerban reton-proteomon en klinike utilajn sistem-bazitajn biosignojn, ni kombinis la cerb-derivitan reton kun la proteomia analizo de AD CSF. Ĉi tiu integra aliro kondukis al la identigo de kvin promesplenaj aroj de CSF-biosignoj kiuj estas asociitaj kun larĝa gamo de cerb-bazita patofiziologio, inkluzive de sinapsoj, sangaj glasoj, mjelinigo, inflamo kaj misfunkcio de metabolaj vojoj. Ni sukcese validigis ĉi tiujn biomarkajn panelojn per multoblaj reproduktaj analizoj, inkluzive de pli ol 500 CSF-specimenoj de diversaj neŭrodegeneraj malsanoj. Ĉi tiuj validumaj analizoj inkluzivas ekzamenadon de grupceloj en la CSF de pacientoj kun sensimptoma AD (AsymAD) aŭ montri signojn de nenormala amiloida amasiĝo en normala kogna medio. Tiuj analizoj elstarigas la signifan biologian heterogenecon en la AsymAD-populacio kaj identigas panelsignojn kiuj eble povas subtajpi individuojn en la plej fruaj stadioj de la malsano. Ĝenerale, ĉi tiuj rezultoj reprezentas ŝlosilan paŝon en la disvolviĝo de proteinaj biomarkiloj bazitaj sur multoblaj sistemoj, kiuj povas sukcese solvi multajn el la klinikaj defioj alfrontataj de AD.
La ĉefa celo de ĉi tiu studo estas identigi novajn cerbospinajn likvajn biosignojn, kiuj reflektas diversajn cerb-bazitan patofiziologion, kiuj kondukas al AD. Figuro S1 skizas nian esplormetodaron, kiu inkluzivas (i) ampleksan analizon gviditan per preparaj trovoj de AD CSF kaj la reto cerba proteomo por identigi multoblajn cerb-rilatajn CSF-malsan-biosignojn, kaj (ii) postan reproduktadon. Ĉi tiuj biosignoj estas en pluraj sendependaj cerbospinaj. fluidaj kohortoj. La eltrovaĵ-orientita esplorado komenciĝis per la analizo de la diferenciga esprimo de CSF en 20 kogne normalaj individuoj kaj 20 AD-pacientoj ĉe Emory Goizueta Alzheimer's Disease Research Center (ADRC). La diagnozo de AD estas difinita kiel signifa kogna difekto en la ĉeesto de malalta Aβ1-42 kaj altaj niveloj de totala tau kaj p-tau en la cerbo-spina likvaĵo [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA). )]] (Tabelo S1A). La kontrolo (meza MoCA, 26.7 ± 2.2) havis normalajn nivelojn de CSF-biomarkoj.
Homa CSF estas karakterizita per dinamika gamo de proteina abundo, en kiu albumino kaj aliaj ekstreme abundaj proteinoj povas malhelpi la detekton de proteinoj de intereso (24). Por pliigi la profundon de malkovro de proteinoj, ni forigis la unuajn 14 tre abundajn proteinojn de ĉiu CSF-provaĵo antaŭ analizo de mas-spektrometria (MS) (24). Totalo de 39,805 peptidoj estis identigita fare de MS, kiuj estis mapitaj al 3691 proteomoj en 40 provaĵoj. Proteina kvantigo estas farita per multobla tandema masetikedo (TMT) etikedado (18, 25). Por solvi la mankantajn datumojn, ni inkluzivis nur tiujn proteinojn, kiuj estis kvantigitaj en almenaŭ 50% de la specimenoj en la posta analizo, tiel finfine kvantigante 2875 proteomojn. Pro la signifa diferenco en totalaj proteinabundaj niveloj, kontrolprovaĵo estis statistike konsiderita eksterordinara (13) kaj ne estis inkludita en la posta analizo. La abundovaloroj de la ceteraj 39 specimenoj estis ĝustigitaj laŭ aĝo, sekso kaj grupa kunvarianco (13-15, 17, 18, 20, 26).
Uzante statistikan t-testan analizon por taksi diferencigan esprimon sur la regresa datuma aro, ĉi tiu analizo identigis proteinojn kies abundoniveloj estis signife ŝanĝitaj (P <0.05) inter la kontrolo kaj AD kazoj (Tablo S2A). Kiel montrite en Figuro 1A, la abundo de totalo de 225 proteinoj en AD estis signife reduktita, kaj la abundo de 303 proteinoj estis signife pliigita. Ĉi tiuj diferencige esprimitaj proteinoj inkluzivas plurajn antaŭe identigitajn cerbo-spinajn likvajn AD-signojn, kiel ekzemple mikrotubul-rilata proteino tau (MAPT; P = 3.52 × 10−8), neŭrofilamento (NEFL; P = 6.56 × 10−3), kresk-rilata Proteino 43 (GAP43; P = 1.46 × 10−5), Fatty Acid Binding Protein 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), Chitinase 3 kiel 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), Neural Granulin (NRGN; P = 3.43 × 10−4) kaj VGF-nerva kreskfaktoro (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6). Tamen, ni ankaŭ identigis aliajn tre gravajn celojn, kiel GDP-disociiga inhibitoro 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) kaj SPARC-rilata modula kalcia ligado 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9). Gene Ontology (GO) analizo de 225 signife reduktitaj proteinoj malkaŝis proksimajn ligojn kun korpaj fluidaj procezoj kiel steroidmetabolo, sangokoagulado kaj hormona aktiveco (Figuro 1B kaj Tabelo S2B). Kontraste, la signife pliigita proteino de 303 estas proksime rilatita al ĉela strukturo kaj energia metabolo.
(A) La vulkanintrigo montras la log2-faldŝanĝon (x-akso) relative al la -log10-statistika P-valoro (y-akso) akirita per la t-testo, kiu estas uzata por detekti diferencigan esprimon inter la kontrolo (CT) kaj AD kazoj de la CSF-proteomo De ĉiuj proteinoj. Proteinoj kun signife reduktitaj niveloj (P <0.05) en AD estas montritaj en bluo, dum proteinoj kun signife pliigitaj niveloj en malsano estas montritaj en ruĝa. La elektita proteino estas etikedita. (B) La ĉefaj GO-terminoj rilataj al proteino estas signife reduktitaj (bluaj) kaj pliigitaj (ruĝaj) en AD. Montras la tri GO-terminojn kun la plej altaj z-poentaro en la kampoj de biologiaj procezoj, molekulaj funkcioj kaj ĉelaj komponantoj. (C) MS mezuris MAPT-nivelon en CSF-provaĵo (maldekstre) kaj ĝian korelacion kun specimena ELISA tau-nivelo (dekstre). La Pearson-korelacia koeficiento kun la koncerna P-valoro estas montrata. Pro la manko de ELISA-datumoj por unu AD-kazo, ĉi tiuj ciferoj inkluzivas valorojn por 38 el la 39 analizitaj kazoj. (D) Kontrolita cluster-analizo (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) ĝustigita P <0.01) sur la kontrolo kaj AD CSF trovis specimenojn uzante la 65 plej signife ŝanĝitajn proteinojn en la datuma aro. Normigi, normaligi.
La proteomia nivelo de MAPT estas proksime rilatita al la sendepende mezurita ELISA tau-nivelo (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; Figuro 1C), apogante la validecon de nia MS-mezurado. Post tripsina digestado ĉe la nivelo de amiloida antaŭproteino (APP), la izoform-specifaj peptidoj mapitaj al la C-finaĵo de Aβ1-40 kaj Aβ1-42 ne povas esti jonigitaj efike (27, 28). Tial, la APP-peptidoj, kiujn ni identigis, havas nenion komunan kun ELISA Aβ1-42-niveloj. Por taksi la diferencigan esprimon de ĉiu kazo, ni uzis diferencige esprimitajn proteinojn kun P <0.0001 [falsa malkovro-indico (FDR) korektita P <0.01] por fari kontrolitan grupan analizon de la specimenoj (Tablo S2A). Kiel montrite en Figuro 1D, ĉi tiuj 65 tre signifaj proteinoj povas ĝuste kolekti specimenojn laŭ malsanstato, krom unu AD-kazo kun reg-similaj trajtoj. El tiuj 65 proteinoj, 63 pliiĝis en AD, dum nur du (CD74 kaj ISLR) malpliiĝis. Entute, ĉi tiuj analizoj de cerbo-spina fluido identigis centojn da proteinoj en AD, kiuj povas funkcii kiel malsano-biosignoj.
Poste ni faris sendependan retan analizon de la AD-cerba proteomo. La cerba kohorto de ĉi tiu malkovro inkludis dorsoflankan antaŭfrontan kortekso (DLPFC) de kontrolo (n = 10), Parkinson-malsano (PD; n = 10), miksitaj AD/PD (n = 10) kaj AD (n = 10) kazoj. ) Specimeno. Emery Goizueta ADRC. La demografio de ĉi tiuj 40 kazoj estis antaŭe priskribitaj (25) kaj estas resumitaj en Tabelo S1B. Ni uzis TMT-MS por analizi ĉi tiujn 40 cerbajn histojn kaj la reproduktan kohorton de 27 kazoj. Entute, ĉi tiuj du cerbaj datenoj produktis 227,121 unikajn peptidojn, kiuj estis mapitaj al 12,943 proteomoj (25). Nur tiuj proteinoj kiuj estis kvantigitaj en almenaŭ 50% de kazoj estis inkluditaj en postaj esploroj. La fina malkovra datumaro enhavas 8817 kvantigitajn proteinojn. Alĝustigu proteinajn abundecojn surbaze de aĝo, sekso kaj postmorta intervalo (PMI). La diferenciga esprima analizo de la datuma aro post regreso montris, ke >2000 proteinaj niveloj estis signife ŝanĝitaj [P <0.05, analizo de varianco (ANOVA)] en du aŭ pli da malsano-kohortoj. Poste, ni faris kontrolitan grupan analizon bazitan sur la diferencige esprimitaj proteinoj, kaj P <0.0001 en komparoj AD/kontrolo kaj/aŭ AD/PD (Figuro S2, A kaj B, Tabelo S2C). Tiuj 165 tre ŝanĝitaj proteinoj klare prezentas kazojn kun AD-patologio de la kontrolo- kaj PD-provaĵoj, konfirmante la fortajn AD-specifajn ŝanĝojn en la tuta proteomo.
Ni tiam uzis algoritmon nomitan Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) por fari retan analizon sur la malkovrita cerba proteomo, kiu organizas la datuman aron en proteinajn modulojn kun similaj esprimaj ŝablonoj (11-13). La analizo identigis 44 modulojn (M) kunesprimitajn proteinojn, ordigitajn kaj numeritajn de la plej grandaj (M1, n = 1821 proteinoj) ĝis la plej malgrandaj (M44, n = 34 proteinoj) (Figuro 2A kaj Tabelo S2D)). Kiel menciite supre (13) Kalkulu la reprezentan esprimprofilon aŭ karakterizan proteinon de ĉiu modulo, kaj korelaciu ĝin kun la malsana stato kaj AD-patologio, tio estas, starigu la aliancon de Alzheimer's Disease Registry (CERAD) kaj Braak Score (Figuro 2B). Ĝenerale, 17 moduloj estis signife rilataj al AD-neŭropatologio (P <0.05). Multaj el ĉi tiuj malsan-rilataj moduloj ankaŭ estas riĉaj je ĉelaj tipo-specifaj signoj (Figuro 2B). Kiel menciite supre (13), ĉeltipriĉigo estas determinita analizante la modulinterkovron kaj la referencliston de ĉeltip-specifaj genoj. Tiuj genoj estas derivitaj de publikigitaj datenoj en izolitaj musneŭronoj, endoteliaj kaj gliaj ĉeloj. RNA-sekvencado (RNA-seq) eksperimento (29).
(A) Malkovru la WGCNA de la cerba proteomo. (B) Bipeza mezkorelacio (BiCor) analizo de la modula signaturproteino (la unua grava komponento de modula protein-esprimo) kun AD-neŭropatologiaj karakterizaĵoj (supro), inkluzive de CERAD (Aβ-plako) kaj Braak (tau-tangloj) poentaroj. La intensecoj de pozitivaj (ruĝaj) kaj negativaj (bluaj) korelacioj estas montritaj per dukolora varmomapo, kaj asteriskoj indikas statistikan signifon (P <0.05). Uzu Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (malsupre) por taksi la ĉeltipan asocion de ĉiu proteina modulo. La intenseco de la ruĝa nuanco indikas la gradon de ĉeltipa riĉigo, kaj la asterisko indikas statistikan signifon (P <0.05). Uzu la BH-metodon por korekti la P-valoron derivitan de la FET. (C) GO analizo de modulaj proteinoj. La plej proksime rilataj biologiaj procezoj estas montritaj por ĉiu modulo aŭ rilata modulgrupo. oligo, oligodendrocito.
Aro de kvin proksime rilataj astrocitoj kaj mikroglia-riĉaj moduloj (M30, M29, M18, M24 kaj M5) montris fortan pozitivan korelacion kun AD-neŭropatologio (Figuro 2B). Ontologia analizo ligas ĉi tiujn gliajn modulojn kun ĉela kresko, proliferado kaj imuneco (Figuro 2C kaj Tabelo S2E). Du kromaj gliaj moduloj, M8 kaj M22, ankaŭ estas forte plialtigitaj en malsano. M8 estas tre rilata al la Toll-simila receptora vojo, signala kaskado, kiu ludas ŝlosilan rolon en la denaska imuna respondo (30). En la sama tempo, M22 estas proksime rilatita al post-traduka modifo. M2, kiu estas riĉa je oligodendrocitoj, montras fortan pozitivan korelacion kun AD-patologio kaj ontologian ligon kun nukleosidsintezo kaj DNA-reproduktado, indikante plifortigitan ĉelmultobliĝon en malsanoj. Ĝenerale, ĉi tiuj trovoj subtenas la altecon de gliaj moduloj, kiujn ni antaŭe observis en la AD-reto-proteomo (13, 17). Estas nuntempe trovita ke multaj AD-rilataj gliaj moduloj en la reto montras pli malaltajn esprimnivelojn en kontrolo kaj PD-kazoj, elstarigante sian malsanspecifecon kiu estas levita en AD (Figuro S2C).
Nur kvar moduloj en nia retproteomo (M1, M3, M10 kaj M32) estas forte negative korelaciitaj kun AD-patologio (P <0.05) (Figuro 2, B kaj C). Kaj M1 kaj M3 estas riĉaj je neŭronaj signoj. M1 estas tre rilata al sinaptaj signaloj, dum M3 estas proksime rilatita al mitokondria funkcio. Ekzistas neniuj signoj de ĉeltipriĉigo por M10 kaj M32. M32 reflektas la ligon inter M3 kaj ĉelmetabolo, dum M10 estas tre rilata al ĉelkresko kaj mikrotubulfunkcio. Kompare kun AD, ĉiuj kvar moduloj pliiĝas en kontrolo kaj PD, donante al ili malsano-specifajn AD-ŝanĝojn (Figuro S2C). Ĝenerale, ĉi tiuj rezultoj subtenas la malpliigitan abundon de neŭron-riĉaj moduloj, kiujn ni antaŭe observis en AD (13, 17). Resume, la reta analizo de la cerba proteomo, kiun ni malkovris, produktis AD-specife ŝanĝitajn modulojn kongruajn kun niaj antaŭaj trovoj.
AD estas karakterizita per frua sensimptoma stadio (AsymAD), en kiu individuoj elmontras amiloidan amasiĝon sen klinika kogna malkresko (5, 31). Ĉi tiu sensimptoma stadio reprezentas kritikan fenestron por frua detekto kaj interveno. Ni antaŭe pruvis fortan modulan konservadon de AsymAD kaj AD-cerba reto-proteomo tra sendependaj datumserioj (13, 17). Por certigi, ke la cerba reto, kiun ni nuntempe malkovris, kongruas kun ĉi tiuj antaŭaj trovoj, ni analizis la konservadon de 44 moduloj en la reproduktita datumaro de 27 DLPFC-organizoj. Ĉi tiuj organizoj inkluzivas kontrolon (n = 10), AsymAD (n = 8) Kaj AD (n = 9) kazojn. Kontrolaj kaj AD-provaĵoj estis inkluditaj en la analizo de nia malkovra cerba kohorto (Tablo S1B), dum AsymAD-kazoj estis unikaj nur en la reprodukta kohorto. Tiuj AsymAD-kazoj ankaŭ venis de la Emory Goizueta ADRC cerba banko. Kvankam ekkono estis normala dum la morto, amiloidaj niveloj estis nenormale altaj (meza CERAD, 2.8 ± 0.5) (Tablo S1B).
TMT-MS-analizo de ĉi tiuj 27 cerbaj histoj rezultigis la kvantigon de 11,244 proteomoj. Ĉi tiu fina kalkulo inkluzivas nur tiujn proteinojn kvantigitajn en almenaŭ 50% de la specimenoj. Ĉi tiu reproduktita datumaro enhavas 8638 (98.0%) el la 8817 proteinoj detektitaj en nia malkovra cerba analizo, kaj havas preskaŭ 3000 signife ŝanĝitajn proteinojn inter la kohortoj de kontrolo kaj AD (P <0.05, post la parigita t-testo de Tukey por analizo de varianco) ( Tabelo S2F). Inter ĉi tiuj diferencige esprimitaj proteinoj, 910 ankaŭ montris signifajn nivelŝanĝojn inter AD kaj cerbaj proteomaj kontrolkazoj (P <0.05, post ANOVA Tukey parigita t-testo). Indas noti, ke ĉi tiuj 910-markoj estas tre konsekvencaj en la direkto de ŝanĝo inter proteomoj (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (Figuro S3A). Inter la pliigitaj proteinoj, la proteinoj kun la plej konsekvencaj ŝanĝoj inter datumserioj estas plejparte membroj de la glial-riĉaj M5 kaj M18-moduloj (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, kaj GFAP). Inter la reduktitaj proteinoj, tiuj kun la plej konsekvencaj ŝanĝoj preskaŭ estis ekskluzive membroj de la M1-modulo (NPTX2, VGF, kaj RPH3A) asociita kun la sinapso. Ni plue kontrolis la AD-rilatajn ŝanĝojn de midkine (MDK), CD44, kaŝita frizzled-rilata proteino 1 (SFRP1) kaj VGF per okcidenta blotting (Figuro S3B). Analizo pri modula konservado montris, ke ĉirkaŭ 80% de la proteinaj moduloj (34/44) en la cerba proteomo estis signife konservitaj en la reproduktada datumo (z-poentaro> 1.96, FDR korektita P <0.05) (Figuro S3C). Dek kvar el ĉi tiuj moduloj estis speciale rezervitaj inter la du proteomoj (z-poentaro> 10, FDR korektita P <1.0 × 10−23). Ĝenerale, la malkovro kaj reproduktado de la alta grado da konsistenco en diferenciga esprimo kaj modula kunmetaĵo inter la cerba proteomo elstarigas la reprodukteblecon de la ŝanĝoj en AD-fruntkorteksoproteinoj. Krome, ĝi ankaŭ konfirmis, ke AsymAD kaj pli progresintaj malsanoj havas tre similan cerban retan strukturon.
Pli detala analizo de la diferenciga esprimo en la cerba reproduktaddatumaro elstarigas la signifan gradon da AsymAD-proteinŝanĝoj, inkluzive de totalo de 151 signife ŝanĝitaj proteinoj inter AsymAD kaj la kontrolo (P <0.05) (Figuro S3D). Konsekvence kun la amiloida ŝarĝo, APP en la cerbo de AsymAD kaj AD pliiĝis signife. MAPT nur signife ŝanĝiĝas en AD, kio kongruas kun pliigitaj niveloj de implikaĵoj kaj ĝia konata korelacio kun kogna malkresko (5, 7). La glial-riĉaj moduloj (M5 kaj M18) estas tre reflektitaj en la pliigitaj proteinoj en AsymAD, dum la neŭron-rilata M1-modulo estas la plej reprezentanto de la malkreskintaj proteinoj en AsymAD. Multaj el ĉi tiuj signoj de AsymAD montras pli grandajn ŝanĝojn en simptomaj malsanoj. Inter ĉi tiuj markiloj estas SMOC1, glia proteino apartenanta al M18, kiu estas asociita kun cerbaj tumoroj kaj la disvolviĝo de okuloj kaj membroj (32). MDK estas heparin-liga kreskfaktoro rilata al ĉelkresko kaj angiogenezo (33), alia membro de M18. Kompare kun la kontrolgrupo, AsymAD pliiĝis signife, sekvita de pli granda pliiĝo en AD. En kontrasto, la sinapta proteino neuropentraxin 2 (NPTX2) estis signife reduktita en la AsymAD-cerbo. NPTX2 antaŭe estis asociita kun neŭrodegenero kaj havas agnoskitan rolon en mediaciado de ekscitaj sinapsoj (34). Ĝenerale, ĉi tiuj rezultoj rivelas diversajn malsamajn antaŭklinigajn proteinŝanĝojn en AD, kiuj ŝajnas progresi kun la severeco de la malsano.
Konsiderante ke ni atingis signifan profundon de proteina kovrado en la eltrovo de la cerba proteomo, ni provas kompreni pli plene ĝian interkovron kun la retnivela AD-transkriptomo. Sekve, ni komparis la cerban proteomon, kiun ni malkovris kun la modulo, kiun ni antaŭe generis el la mikroarray-mezurado de 18,204 genoj en AD (n = 308) kaj kontrolo (n = 157) DLPFC-histoj (13). interkovrante. Entute, ni identigis 20 malsamajn RNA-modulojn, multaj el kiuj pruvis la riĉigon de specifaj ĉeltipoj, inkluzive de neŭronoj, oligodendrocitoj, astrocitoj kaj mikroglia (Figuro 3A). La multoblaj ŝanĝoj de ĉi tiuj moduloj en AD estas montritaj en Figuro 3B. Konsekvence kun nia antaŭa analizo de interkovro de proteino-RNA uzante la pli profundan neetikeditan MS-proteomon (ĉirkaŭ 3000 proteinoj) (13), la plej multaj el la 44 moduloj en la cerba proteom-reto, kiujn ni trovis, estas en la transcriptoma reto. Ne estas signifa interkovro. nia malkovro kaj reproduktado de la 34 proteinmoduloj kiuj estas tre retenitaj en la cerba proteomo, nur 14 (~40%) trapasis la precizan teston de Fisher (FET) pruvis havi statistike signifan interkovron kun la transcriptome (Figuro 3A). Kongrua kun riparo de DNA-damaĝo (P-M25 kaj P-M19), proteintradukado (P-M7 kaj P-M20), RNA-ligado/splisado (P-M16 kaj P-M21) kaj proteincelado (P-M13 kaj P-). M23) ne interkovras kun moduloj en la transkriptomo. Tial, kvankam pli profunda proteoma datumaro estas uzata en la nuna interkovra analizo (13), la plej granda parto de la AD-retoproteomo ne estas mapita al la transcriptoma reto.
(A) Hipergeometria FET montras la riĉigon de ĉelaj tipo-specifaj signoj en la RNA-modulo de la AD-transkriptomo (supro) kaj la gradon de interkovro inter la RNA (x-akso) kaj proteino (y-akso) moduloj de la AD-cerbo. (malsupro). La intenseco de la ruĝa ombro indikas la gradon de riĉiĝo de ĉeltipoj en la supra panelo kaj la intensecon de la interkovro de la moduloj en la malsupra panelo. Asteriskoj indikas statistikan signifon (P <0.05). (B) La grado de korelacio inter la karakterizaj genoj de ĉiu transcriptoma modulo kaj AD-statuso. La moduloj maldekstre estas la plej negative korelaciitaj kun AD (blua), kaj tiuj dekstre estas la plej pozitive korelaciitaj kun AD (ruĝa). La log-transformita BH-korektita P valoro indikas la gradon da statistika signifo de ĉiu korelacio. (C) Signifaj interkovrantaj moduloj kun komuna ĉeltipa riĉigo. (D) Korelacianalizo de la log2-falda ŝanĝo de la etikedita proteino (x-akso) kaj RNA (y-akso) en la imbrikita modulo. La Pearson-korelacia koeficiento kun la koncerna P-valoro estas montrata. Mikro, mikroglia; ĉielaj korpoj, astrocitoj. CT, kontrolo.
Plej imbrikitaj proteinoj kaj RNA-moduloj dividas similajn ĉeltipriĉigajn profilojn kaj konsekvencajn AD-ŝanĝdirektojn (Figuro 3, B kaj C). Alivorte, la sinaps-rilata M1-modulo de la cerba proteomo (PM 1) estas mapita al tri neuronal-riĉaj homologaj RNA-moduloj (R-M1, R-M9 kaj R-M16), kiuj estas en AD Ambaŭ montris. reduktita nivelo. Simile, la glial-riĉaj M5 kaj M18 proteinmoduloj interkovras kun RNA-moduloj riĉaj en astrocitoj kaj mikrogliaj signoj (R-M3, R-M7, kaj R-M10) kaj estas tre implikitaj en malsanoj Pliiĝo. Ĉi tiuj komunaj modulaj trajtoj inter la du datenoj plue subtenas la ĉeltipriĉigon kaj malsan-rilatajn ŝanĝojn, kiujn ni observis en la cerba proteomo. Tamen, ni observis multajn signifajn diferencojn inter la RNA kaj proteinaj niveloj de individuaj signoj en ĉi tiuj komunaj moduloj. Korelacianalizo de la diferenciga esprimo de la proteomiko kaj transcriptomics de la molekuloj ene de ĉi tiuj interkovritaj moduloj (Figuro 3D) elstarigas ĉi tiun nekonsekvencon. Ekzemple, APP kaj pluraj aliaj gliaj modulproteinoj (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, kaj SFRP1) montris signifan pliiĝon en la AD-proteomo, sed ekzistis preskaŭ neniu ŝanĝo en la AD-transkriptomo. Ĉi tiuj protein-specifaj ŝanĝoj povas esti proksime rilatitaj al amiloidaj plakoj (23, 35), elstarigante la proteomon kiel la fonton de patologiaj ŝanĝoj, kaj ĉi tiuj ŝanĝoj eble ne reflektiĝas en la transkriptomo.
Post sendepende analizi la cerbon kaj CSF-proteomojn, kiujn ni malkovris, ni faris ampleksan analizon de la du datumaj aroj por identigi AD CSF-biomarkojn rilatajn al la patofiziologio de la cerba reto. Ni unue devas difini la interkovron de la du proteomoj. Kvankam estas vaste akceptite, ke CSF reflektas neŭrokemiajn ŝanĝojn en la AD-cerbo (4), la preciza grado de interkovro inter la AD-cerbo kaj la CSF-proteomo estas neklara. Komparante la nombron da komunaj genproduktoj detektitaj en niaj du proteomoj, ni trovis, ke preskaŭ 70% (n = 1936) de la proteinoj identigitaj en la cerbo-spina fluido ankaŭ estis kvantigitaj en la cerbo (Figuro 4A). La plej multaj el ĉi tiuj imbrikitaj proteinoj (n = 1721) estas mapitaj al unu el 44 kunesprimaj moduloj de la malkovra cerba datumaro (Figuro 4B). Kiel atendite, la ses plej grandaj cerbaj moduloj (M1 ĝis M6) elmontris la plej grandan kvanton de CSF-interkovro. Tamen, ekzistas pli malgrandaj cerbaj moduloj (ekzemple, M15 kaj M29) kiuj atingas neatendite altan gradon de interkovro, pli granda ol cerba modulo duoble ĝia grandeco. Ĉi tio instigas nin adopti pli detalan, statistike movitan metodon por kalkuli la interkovron inter la cerbo kaj cerbospina likvaĵo.
(A kaj B) La proteinoj detektitaj en la malkovrocerbo kaj CSF-datumserioj interkovras. La plej multaj el tiuj imbrikitaj proteinoj estas rilataj al unu el la 44 kunesprimmoduloj de la cerba kunesprimreto. (C) Malkovru la interkovron inter la cerbospina likva proteomo kaj la cerba reto proteomo. Ĉiu vico de la varmomapo reprezentas apartan interkovran analizon de la hipergeometria FET. La supra vico prezentas la interkovron (griza/nigra ombro) inter la cerba modulo kaj la tuta CSF-proteomo. La dua linio prezentas ke la interkovro inter cerbaj moduloj kaj CSF-proteino (ombrita en ruĝa) estas signife supren-reguligita en AD (P <0.05). La tria vico montras, ke la interkovro inter cerbaj moduloj kaj CSF-proteino (blua ombro) estas signife subreguligita en AD (P <0.05). Uzu la BH-metodon por korekti la P-valoron derivitan de la FET. (D) Faldebla modula panelo bazita sur ĉelspeca asocio kaj rilataj GO-terminoj. Tiuj paneloj enhavas totalon de 271 cerb-rilataj proteinoj, kiuj havas senchavan diferencigan esprimon en la CSF-proteomo.
Uzante unuvostajn FETojn, ni taksis la gravecon de proteininterkovro inter la CSF-proteomo kaj individuaj cerbaj moduloj. La analizo malkaŝis, ke entute 14 cerbaj moduloj en la CSF-datumaro havas statistike signifajn interkovrojn (FDR ĝustigita P <0.05), kaj kroma modulo (M18) kies interkovro estas proksima al signifo (FDR ĝustigita P = 0.06) (Figuro 4C). , supra vico). Ni ankaŭ interesiĝas pri moduloj, kiuj forte interkovras kun diferencige esprimitaj CSF-proteinoj. Tial, ni aplikis du pliajn FET-analizojn por determini kiu el (i) CSF-proteino estis signife pliigita en AD kaj (ii) CSF-proteino estis signife malpliigita en AD (P <0.05, parigita t-test AD/kontrolo) Cerbaj moduloj kun signifa interkovro. inter ili. Kiel montrite en la mezaj kaj malsupraj vicoj de Figuro 4C, ĉi tiuj kromaj analizoj montras, ke 8 el la 44 cerbaj moduloj signife interkovras kun la proteino aldonita en AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 kaj M38) . ), dum nur du moduloj (M6 kaj M15) montris signifan interkovron kun la reduktita proteino en AD CSF. Kiel atendite, ĉiuj 10 moduloj estas en la 15 moduloj kun la plej alta interkovro kun la CSF-proteomo. Sekve, ni supozas, ke ĉi tiuj 15 moduloj estas alt-rendimentaj fontoj de AD cerb-devenaj CSF-biosignoj.
Ni faldis ĉi tiujn 15 interkovrajn modulojn en kvin grandajn proteinajn panelojn bazitajn sur ilia proksimeco en la WGCNA-arba diagramo kaj ilia asocio kun ĉeltipoj kaj gena ontologio (Figuro 4D). La unua panelo enhavas modulojn riĉajn je neŭronaj signoj kaj sinaps-rilataj proteinoj (M1 kaj M12). La sinapta panelo enhavas totalon de 94 proteinoj, kaj la niveloj en la CSF-proteomo signife ŝanĝiĝis, igante ĝin la plej granda fonto de cerb-rilataj CSF-signoj inter la kvin paneloj. La dua grupo (M6 kaj M15) montris la proksiman ligon kun endoteliaj ĉelaj signoj kaj vaskula korpo, kiel "vundo-resanigo" (M6) kaj "reguligo de humura imuna respondo" (M15). M15 ankaŭ estas tre rilata al lipoproteina metabolo, kiu estas proksime rilata al endotelio (36). La angia panelo enhavas 34 CSF-signojn rilatajn al la cerbo. La tria grupo inkludas modulojn (M2 kaj M4) kiuj estas signife rilataj al oligodendrocitaj signoj kaj ĉela proliferado. Ekzemple, la pintnivelaj ontologioperiodoj de M2 inkludas "pozitivan reguligon de DNA-reproduktado" kaj "purinan biosintezprocezon". Dume, tiuj de M4 inkluzivas "glial-ĉeldiferencigon" kaj "kromosoman apartigon". La mjeliniga panelo enhavas 49 CSF-signojn rilatajn al la cerbo.
La kvara grupo enhavas la plej multajn modulojn (M30, M29, M18, M24, kaj M5), kaj preskaŭ ĉiuj moduloj estas signife riĉaj je mikroglia kaj astrocitaj signoj. Simila al la mjeliniga panelo, la kvara panelo ankaŭ enhavas modulojn (M30, M29, kaj M18) kiuj estas proksime rilataj al ĉelmultobliĝo. La aliaj moduloj en ĉi tiu grupo estas tre rilataj al imunologiaj terminoj, kiel "procezo de imuna efiko" (M5) kaj "reguligo de imunrespondo" (M24). La glia imuna grupo enhavas 42 CSF-signojn rilatajn al la cerbo. Fine, la lasta panelo inkluzivas 52 cerb-rilatajn markilojn sur la kvar moduloj (M44, M3, M33 kaj M38), ĉiuj el kiuj estas sur la korpo rilataj al energistokado kaj metabolo. La plej granda el tiuj moduloj (M3) estas proksime rilatita al mitokondrioj kaj estas riĉa je neŭron-specifaj signoj. M38 estas unu el la pli malgrandaj modulmembroj en tiu metabolomo kaj ankaŭ elmontras moderan neŭronspecifecon.
Ĝenerale, ĉi tiuj kvin paneloj reflektas larĝan gamon de ĉeltipoj kaj funkcioj en la AD-kortekso, kaj kolektive enhavas 271 cerb-rilatajn CSF-signojn (Tablo S2G). Por taksi la validecon de ĉi tiuj MS-rezultoj, ni uzis la analizon de proksimeco-etendaĵo (PEA), ortogonalan antikorp-bazitan teknologion kun multipleksaj kapabloj, alta sentemo kaj specifeco, kaj reanalizis la cerbo-spinan fluidajn specimenojn, kiujn ni trovis Subaron de ĉi tiuj 271 biosignoj. (n = 36). Ĉi tiuj 36 celoj pruvas la ŝanĝon en la AD-oblo de PEA, kiu estas proksime rilata al niaj MS-bazitaj trovoj (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12), Kiu forte kontrolis la rezultojn de nia ampleksa MS-analizo (Figuro S4). ).
La biologiaj temoj emfazitaj de niaj kvin grupoj, de sinapta signalado ĝis energia metabolo, ĉiuj rilatas al la patogenezo de AD (1-3). Tial, ĉiuj 15 moduloj enhavantaj ĉi tiujn panelojn rilatas al la AD-patologio en la cerba proteomo, kiun ni malkovris (Figuro 2B). La plej rimarkinda estas la alta pozitiva patologia korelacio inter niaj gliaj moduloj kaj la forta negativa patologia korelacio inter niaj plej grandaj neŭronaj moduloj (M1 kaj M3). La diferenciga esprimo-analizo de nia reproduktita cerba proteomo (Figuro S3D) ankaŭ elstarigas M5 kaj M18-derivitajn gliajn proteinojn. En AsymAD kaj simptoma AD, la plej pliigis glialproteinojn kaj M1-rilatajn sinapsojn La proteino estas reduktita plej. Ĉi tiuj observoj indikas, ke la 271 signoj de cerbospina fluido, kiujn ni identigis en la kvin grupoj, rilatas al malsanprocezoj en la AD-kortekso, inkluzive de tiuj, kiuj okazas en la fruaj sensimptomaj stadioj.
Por pli bone analizi la ŝanĝdirekton de la panelaj proteinoj en la cerbo kaj mjellikvo, ni desegnis la jenon por ĉiu el la 15 interkovritaj moduloj: (i) trovis la modulan abundnivelon en la cerba datumaro kaj (ii) la modulo. proteino La diferenco estas esprimita en la cerboespina likvaĵo (Figuro S5). Kiel menciite antaŭe, WGCNA estas uzata por determini la modulan abundon aŭ karakterizan proteinvaloron en la cerbo (13). La vulkanmapo estas utiligita por priskribi la diferencigan esprimon de modulaj proteinoj en la cerbo-spina likvaĵo (AD/kontrolo). Ĉi tiuj figuroj montras, ke tri el la kvin paneloj montras malsamajn esprimtendencojn en la cerbo kaj mjellikvo. La du moduloj de la sinapsa panelo (M1 kaj M12) montras malkreskon en la abundonivelo en la AD-cerbo, sed signife interkovras kun la pliigita proteino en la AD CSF (Figuro S5A). La neŭron-rilataj moduloj enhavantaj la metabolomon (M3 kaj M38) montris similajn cerbajn kaj cerbospinajn esprimmodulojn malkonsekvencajn (Figuro S5E). La angia panelo ankaŭ montris malsamajn esprimajn tendencojn, kvankam ĝiaj moduloj (M6 kaj M15) estis modere pliigitaj en la AD-cerbo kaj malpliiĝis en la malsana CSF (Figuro S5B). La ceteraj du paneloj enhavas grandajn gliajn retojn, kies proteinoj estas konstante supren-reguligitaj en ambaŭ kupeoj (Figuro S5, C kaj D).
Bonvolu noti, ke ĉi tiuj tendencoj ne estas komunaj al ĉiuj markiloj en ĉi tiuj paneloj. Ekzemple, la sinapta panelo inkluzivas plurajn proteinojn, kiuj estas signife reduktitaj en la AD-cerbo kaj CSF (Figuro S5A). Inter tiuj malsupren-reguligitaj signoj de cerbo-spina likvaĵo estas NPTX2 kaj VGF de M1, kaj kromogranino B de M12. Tamen, malgraŭ ĉi tiuj esceptoj, la plej multaj el niaj sinaptaj markiloj estas plialtigitaj en AD mjellikvo. Ĝenerale, ĉi tiuj analizoj povis distingi statistike signifajn tendencojn en cerbaj kaj cerbo-spinaj fluidaj niveloj en ĉiu el niaj kvin paneloj. Ĉi tiuj tendencoj elstarigas la kompleksan kaj ofte malsaman rilaton inter cerbo kaj CSF-proteina esprimo en AD.
Poste, ni uzis analizon de reproduktado de MS de alta rendimento (CSF-replikado 1) por malvastigi nian 271 aron da biomarkiloj al la plej promesplenaj kaj reprodukteblaj celoj (Figuro 5A). CSF-kopio 1 enhavas entute 96 specimenojn de Emory Goizueta ADRC, inkluzive de kontrolo, AsymAD kaj AD-kohorto (Tablo S1A). Ĉi tiuj AD-kazoj estas karakterizitaj per milda kogna malkresko (meza MoCA, 20.0 ± 3.8), kaj ŝanĝoj en AD-biomarkoj konfirmitaj en cerbo-spina likvaĵo (Tablo S1A). Kontraŭe al la CSF-analizo, kiun ni trovis, ĉi tiu reproduktado estas farita uzante pli efikan kaj altproduktan "unu-pafon" MS-metodon (sen eksterreta frakciigo), inkluzive de simpligita specimena preparprotokolo, kiu forigas la bezonon de imunomalplenigo de individuaj specimenoj. . Anstataŭe, ununura imun-malplenigita "pliboniga kanalo" estas uzata por plifortigi la signalon de malpli abundaj proteinoj (37). Kvankam ĝi reduktas la totalan proteome-kovradon, ĉi tiu unu-pafa metodo signife reduktas maŝinan tempon kaj pliigas la nombron da TMT-etikeditaj provaĵoj, kiuj povas esti analizitaj fareblaj (17, 38). Entute, la analizo identigis 6,487 peptidojn, kiuj mapis al 1,183 proteomoj en 96 kazoj. Kiel kun la CSF-analizo, kiun ni trovis, nur tiuj proteinoj kvantigitaj en almenaŭ 50% de la specimenoj estis inkluditaj en la postaj kalkuloj, kaj la datumoj estis regresitaj por la efikoj de aĝo kaj sekso. Tio kondukis al la fina kvantigo de 792 proteomoj, 95% de kiuj ankaŭ estis identigitaj en la CSF-datumaro trovita.
(A) Cerbo-rilataj CSF-proteinceloj kontrolitaj en la unua reproduktita CSF-kohorto kaj inkluzivitaj en la fina panelo (n = 60). (B al E) Panelaj biosigno-niveloj (kunmetitaj z-poentaro) mezuritaj en la kvar CSF-reproduktaj kohortoj. Parigitaj t-testoj aŭ ANOVA kun la post-ĝustigo de Tukey estis uzataj por taksi la statistikan signifon de la ŝanĝoj en abundo en ĉiu kopia analizo. CT, kontrolo.
Ĉar ni precipe interesiĝas pri kontroli niajn 271 cerb-rilatajn CSF-celojn per ampleksa analizo, ni limigos plian ekzamenon de ĉi tiu reproduktita proteomo al ĉi tiuj signoj. Inter ĉi tiuj 271 proteinoj, 100 estis detektitaj en CSF-reproduktado 1. Figuro S6A montras la diferencigan esprimon de ĉi tiuj 100 imbrikitaj signoj inter la kontrolo kaj AD-reproduktaj specimenoj. Sinaptaj kaj metabolitaj histonoj pliiĝas en AD, dum vaskulaj proteinoj malpliiĝas plej en malsano. La plej multaj el la 100 imbrikitaj markiloj (n = 70) konservis la saman direkton de ŝanĝo en la du datumserioj (Figuro S6B). Ĉi tiuj 70 validigitaj cerb-rilataj CSF-markoj (Tablo S2H) plejparte reflektas la antaŭe observitajn panel-esprimtendencojn, tio estas, la malsupren-reguligo de vaskulaj proteinoj kaj la supren-reguligo de ĉiuj aliaj paneloj. Nur 10 el ĉi tiuj 70 validigitaj proteinoj montris ŝanĝojn en AD-abundo, kiuj kontraŭdiris ĉi tiujn paneltendencojn. Por generi panelon, kiu plej bone reflektas la ĝeneralan tendencon de la cerbo kaj cerbo-spina fluido, ni ekskludis ĉi tiujn 10 proteinojn el la interesa panelo, kiun ni finfine kontrolis (Figuro 5A). Tial, nia panelo finfine inkluzivas entute 60 proteinojn kontrolitajn en du sendependaj CSF-AD-kohortoj uzante malsaman specimenan preparadon kaj MS-platforman analizon. La z-poentaraj esprimaj intrigoj de ĉi tiuj finaj paneloj en la CSF-kopio 1-kontrolo kaj AD-kazoj konfirmis la panelan tendencon observitan en la CSF-kohorto, kiun ni trovis (Figuro 5B).
Inter ĉi tiuj 60 proteinoj, ekzistas molekuloj konataj esti asociitaj kun AD, kiel ekzemple osteopontino (SPP1), kiu estas porinflama citokino kiu estis asociita kun AD en multaj studoj (39-41), kaj GAP43, A sinapta proteino. tio estas klare ligita al neŭrodegenero (42). La plej plene kontrolitaj proteinoj estas signoj ligitaj al aliaj neŭrodegeneraj malsanoj, kiel ekzemple amiotrofa laterala sklerozo (ALS) rilata superoksiddismutazo 1 (SOD1) kaj Parkinson-malsano rilata desakarazo (PARK7). Ni ankaŭ kontrolis, ke multaj aliaj markiloj, kiel ekzemple SMOC1 kaj cerba-riĉa membran-aldonaĵo signalanta proteinon 1 (BASP1), limigis antaŭajn ligojn al neŭrodegenero. Indas noti, ke pro ilia malalta totala abundo en la CSF-proteomo, estas malfacile por ni uzi ĉi tiun altproduktan unu-pafon detektan metodon por fidinde detekti MAPT kaj iujn aliajn AD-rilatajn proteinojn (ekzemple, NEFL kaj NRGN. ) ( 43, 44).
Ni tiam kontrolis ĉi tiujn 60 prioritatajn panelajn markilojn en tri pliaj reproduktaj analizoj. En CSF-Kopio 2, ni uzis ununuran TMT-MS por analizi sendependan kohorton de 297 kontrolo kaj AD-provaĵoj de Emory Goizueta ADRC (17). CSF-reproduktado 3 inkludis reanalizon de disponeblaj TMT-MS-datumoj de 120-kontrolaj kaj AD-pacientoj de Laŭzano, Svislando (45). Ni detektis pli ol du trionojn de la 60 prioritataj signoj en ĉiu datumaro. Kvankam la svisa studo uzis malsamajn MS-platformojn kaj TMT-kvantigajn metodojn (45, 46), ni forte reproduktis niajn panelajn tendencojn en du ripetaj analizoj (Figuro 5, C kaj D, kaj Tabloj S2, I kaj J). Por taksi la malsanspecifecon de nia grupo, ni uzis TMT-MS por analizi la kvaran reproduktan datuman aron (CSF-reproduktado 4), kiu inkludis ne nur kontrolon (n = 18) kaj AD (n = 17) kazojn, sed ankaŭ PD ( n = 14)), ALS (n = 18) kaj frontotemporal demenco (FTD) specimenoj (n = 11) (Tablo S1A). Ni sukcese kvantigis preskaŭ du trionojn de la panelaj proteinoj en ĉi tiu kohorto (38 el 60). Ĉi tiuj rezultoj reliefigas la AD-specifajn ŝanĝojn en ĉiuj kvin biomarkaj paneloj (Figuro 5E kaj Tabelo S2K). La pliiĝo en la metabolitgrupo montris la plej fortan AD-specifecon, sekvitan per la mjelinigo kaj glia grupo. En pli malgranda mezuro, FTD ankaŭ montras pliiĝon inter ĉi tiuj paneloj, kiuj povas reflekti similajn eblajn retajn ŝanĝojn (17). Kontraste, ALS kaj PD montris preskaŭ la samajn mjelinigajn, gliajn kaj metabolomajn profilojn kiel la kontrolgrupo. Ĝenerale, malgraŭ diferencoj en specimena preparado, MS-platformo kaj TMT-kvantigaj metodoj, ĉi tiuj ripetaj analizoj montras, ke niaj prioritataj panelaj markiloj havas tre konsekvencajn AD-specifajn ŝanĝojn en pli ol 500 unikaj CSF-specimenoj.
AD-neŭrodegenero estis vaste rekonita plurajn jarojn antaŭ la apero de kognaj simptomoj, do estas urĝa bezono de biosignoj de AsymAD (5, 31). Tamen, pli kaj pli da evidentecoj montras, ke la biologio de AsymAD estas malproksime de homogena, kaj la kompleksa interago de risko kaj fortikeco kondukas al grandaj individuaj diferencoj en la posta progresado de la malsano (47). Kvankam uzataj por identigi AsymAD-kazojn, la niveloj de kernaj CSF-biomarkoj (Aβ1-42, totala tau kaj p-tau) ne pruvis povi fidinde antaŭdiri, kiu progresos al demenco (4, 7), indikante pli. necesas inkluzivi holismajn biomarkilajn ilojn bazitajn sur multoblaj aspektoj de cerba fiziologio por precize tavoligi la riskon de ĉi tiu populacio. Sekve, ni poste analizis nian AD-validigitan biomarkilan panelon en la AsymAD-populacio de CSF-kopio 1. Ĉi tiuj 31 AsymAD-kazoj montris eksternormajn kernajn biomarknivelojn (Aβ1-42/totala tau ELISA-proporcio, <5.5) kaj kompletan scion (meza MoCA, 27.1). ± 2.2) (Tabelo S1A). Krome, ĉiuj individuoj kun AsymAD havas klinikan demencan poentaron de 0, indikante ke ekzistas neniuj signoj de malkresko en ĉiutaga kogna aŭ funkcia efikeco.
Ni unue analizis la nivelojn de la validigitaj paneloj en ĉiuj 96 CSF-replikoj 1, inkluzive de la AsymAD-kohorto. Ni trovis, ke pluraj paneloj en la grupo AsymAD havis signifajn AD-similajn abundajn ŝanĝojn, la vaskula panelo montris malsuprenan tendencon en AsymAD, dum ĉiuj aliaj paneloj montris suprenan tendencon (Figuro 6A). Tial ĉiuj paneloj montris tre signifan korelacion kun ELISA Aβ1-42 kaj totalaj tau-niveloj (Figuro 6B). Kontraste, la korelacio inter la grupo kaj la MoCA-poentaro estas relative malbona. Unu el la pli okulfrapaj trovoj de ĉi tiuj analizoj estas la granda gamo da panelabundoj en la AsymAD-kohorto. Kiel montrite en Figuro 6A, la panela nivelo de la AsymAD-grupo kutime transiras la panelan nivelon de la kontrolgrupo kaj la AD-grupon, montrante relative altan ŝanĝeblecon. Por plu esplori ĉi tiun heterogenecon de AsymAD, ni aplikis Multidimensional Scaling (MDS) analizon al 96 CSF-reproduktado 1 kazoj. MDS-analizo permesas bildigi la similecon inter kazoj bazitaj sur certaj variabloj en la datumaro. Por ĉi tiu amasa analizo, ni nur uzas tiujn validigitajn panelajn markilojn, kiuj havas statistike signifan ŝanĝon (P <0.05, AD/kontrolo) en la CSF-malkovro kaj reproduktado 1 proteomo (n = 29) (Tablo S2L). Ĉi tiu analizo produktis klaran spacan amasiĝon inter niaj kontroloj kaj AD-kazoj (Figuro 6C). En kontrasto, kelkaj AsymAD-kazoj estas klare buligitaj en la kontrolgrupo, dum aliaj situas en AD-kazoj. Por plu esplori ĉi tiun AsymAD-heterogenecon, ni uzis nian MDS-mapon por difini du grupojn de ĉi tiuj AsymAD-kazoj. La unua grupo inkludis AsymAD-kazojn amasigitajn pli proksime al la kontrolo (n = 19), dum la dua grupo estis karakterizita per AsymAD-kazoj kun markilo-profilo pli proksima al AD (n = 12).
(A) La esprimnivelo (z-poentaro) de la CSF-biomarkgrupo en ĉiuj 96 specimenoj en la CSF-reproduktado 1 kohorto, inkluzive de AsymAD. Analizo de varianco kun la post-ĝustigo de Tukey estis uzata por taksi la statistikan signifon de panelaj abundoŝanĝoj. (B) Korelacia analizo de panela proteina abundo-nivelo (z-poentaro) kun MoCA-poentaro kaj totala tau-nivelo en ELISA Aβ1-42 kaj CSF-kopio 1-specimenoj. La Pearson-korelacia koeficiento kun la koncerna P-valoro estas montrata. (C) La MDS de 96 CSF kopio 1 kazoj estis bazita sur la abundo niveloj de 29 validigitaj panelo markiloj, kiuj estis signife ŝanĝitaj en ambaŭ la malkovro kaj CSF kopio 1 datumoj aroj [P <0.05 AD/kontrolo (CT)]. Ĉi tiu analizo estis uzata por dividi la AsymAD-grupon en kontrolon (n = 19) kaj AD (n = 12) subgrupojn. (D) La vulkanintrigo montras la diferencigan esprimon de ĉiuj CSF-reproduktado 1 proteinoj kun log2-obla ŝanĝo (x-akso) relative al la -log10-statistika P-valoro inter la du AsymAD-subgrupoj. La panelaj biosignoj estas koloraj. (E) CSF-reproduktado 1 abundonivelo de la elektgrupo-biomarkoj estas diferencige esprimitaj inter AsymAD-subgrupoj. La postĝustigita analizo de varianco de Tukey estis uzata por taksi statistikan signifon.
Ni ekzamenis la diferencigan proteinan esprimon inter ĉi tiuj kontroloj kaj AD-similaj AsymAD-kazoj (Figuro 6D kaj Tabelo S2L). La rezulta vulkanmapo montras ke 14 panelsignoj ŝanĝiĝis signife inter la du grupoj. La plej multaj el tiuj signoj estas membroj de la sinapso kaj metabolomo. Tamen, SOD1 kaj miristoilated alanin-riĉa proteinkinazo C substrato (MARCKS), kiuj estas membroj de la mjelino kaj glial imungrupoj, respektive, ankaŭ apartenas al ĉi tiu grupo (Figuro 6, D kaj E). La angia panelo ankaŭ kontribuis du markilojn kiuj estis signife reduktitaj en la AD-simila AsymAD-grupo, inkluzive de AE-liganta proteino 1 (AEBP1) kaj komplementa familiano C9. Ne estis signifa diferenco inter la kontrolaj kaj AD-similaj AsymAD-subgrupoj en ELISA AB1-42 (P = 0.38) kaj p-tau (P = 0.28), sed estis ja signifa diferenco en la totala tau-nivelo (P = 0.0031). ) (Fig. S7). Estas pluraj panelaj signoj, kiuj indikas, ke la ŝanĝoj inter la du AsymAD-subgrupoj estas pli signifaj ol la totalaj tau-niveloj (ekzemple, YWHAZ, SOD1 kaj MDH1) (Figuro 6E). Ĝenerale, ĉi tiuj rezultoj indikas, ke nia validigita panelo povas enhavi biomarkojn, kiuj povas subtipi kaj ebla riska tavoliĝo de pacientoj kun sensimptoma malsano.
Estas urĝa bezono de sistem-bazitaj biomarkiloj por pli bone mezuri kaj celi la diversajn patofiziologion malantaŭ AD. Ĉi tiuj iloj estas atenditaj ne nur ŝanĝi nian AD-diagnozan kadron, sed ankaŭ antaŭenigi la adopton de efikaj, specifaj pacientaj kuracaj strategioj (1, 2). Tiucele, ni aplikis nepartian ampleksan proteomikan aliron al AD-cerbo kaj CSF por identigi ret-bazitajn CSF-biosignojn kiuj reflektas larĝan gamon de cerb-bazita patofiziologio. Nia analizo produktis kvin CSF-biomark-panelojn, kiuj (i) reflektas sinapsojn, sangajn glasojn, mjelinon, imunan kaj metabolan misfunkcion; (ii) pruvi fortan reprodukteblecon sur malsamaj MS-platformoj; (iii) Montru progresemajn malsano-specifajn ŝanĝojn dum la fruaj kaj malfruaj stadioj de AD. Ĝenerale, ĉi tiuj trovoj reprezentas promesplenan paŝon al la evoluo de diversaj, fidindaj, ret-orientitaj biomarkiloj por AD-esplorado kaj klinikaj aplikoj.
Niaj rezultoj montras la tre konservitan organizon de la AD-cerba reto-proteomo kaj subtenas ĝian uzon kiel ankro por sistem-bazita biosigno-disvolviĝo. Nia analizo montras, ke du sendependaj TMT-MS-datumseroj enhavantaj AD kaj AsymAD-cerbojn havas fortan modularecon. Ĉi tiuj trovoj plilongigas nian antaŭan laboron, pruvante la konservadon de la potencaj moduloj de pli ol 2,000 cerbaj histoj de multoblaj sendependaj kohortoj en la fronta, parietala kaj temporala kortekso (17). Ĉi tiu interkonsentreto reflektas diversajn malsan-rilatajn ŝanĝojn observitajn en nuna esplorado, inkluzive de la pliiĝo de glial-riĉaj inflamaj moduloj kaj la malkresko de neŭron-riĉaj moduloj. Kiel nuna esplorado, ĉi tiu grandskala reto ankaŭ prezentas signifajn modulajn ŝanĝojn en AsymAD, montrante diversajn malsamajn antaŭklinikan patofiziologion (17).
Tamen, ene de tiu tre konservativa sistem-bazita kadro, ekzistas pli fajngrajna biologia heterogeneco, precipe inter individuoj en la fruaj stadioj de AD. Nia biomarka panelo kapablas prezenti du subgrupojn en AsymAD, kiuj montras la signifan diferencigan esprimon de multoblaj CSF-signoj. Nia grupo povis reliefigi la biologiajn diferencojn inter ĉi tiuj du subgrupoj, kiuj ne estis evidentaj ĉe la nivelo de kernaj AD-biomarkoj. Kompare kun la kontrolgrupo, la Aβ1-42/totala tau-proporcioj de ĉi tiuj AsymAD-individuoj estis nenormale malaltaj. Tamen, nur la totalaj tau-niveloj estis signife malsamaj inter la du AsymAD-subgrupoj, dum la Aβ1-42 kaj p-tau-niveloj restis relative kompareblaj. Ĉar alta CSF-tau ŝajnas esti pli bona prognozilo de kognaj simptomoj ol Aβ1-42-niveloj (7), ni suspektas, ke la du AsymAD-kohortoj povas havi malsamajn riskojn de progresado de malsano. Konsiderante la limigitan specimenan grandecon de nia AsymAD kaj la mankon de longitudaj datumoj, plia esplorado estas necesa por memfide eltiri ĉi tiujn konkludojn. Tamen, ĉi tiuj rezultoj indikas, ke sistem-bazita CSF-panelo povas plibonigi nian kapablon efike tavoligi individuojn dum la sensimptoma stadio de la malsano.
Ĝenerale, niaj trovoj subtenas la rolon de multoblaj biologiaj funkcioj en la patogenezo de AD. Tamen, malreguligita energia metabolo fariĝis la elstara temo de ĉiuj niaj kvin validigitaj etikedaj paneloj. Metabolaj proteinoj, kiel ekzemple hipoxantin-guanina fosforibosiltransferazo 1 (HPRT1) kaj laktatdehidrogenazo A (LDHA), estas la plej fortike validigitaj sinaptaj biosignoj, indikante ke la pliiĝo en AD CSF estas tre reproduktebla sekso. Niaj sangaj glasoj kaj gliaj paneloj ankaŭ enhavas plurajn markilojn implikitajn en la metabolo de oksidaj substancoj. Ĉi tiuj trovoj estas kongruaj kun la ŝlosila rolo, kiun metabolaj procezoj ludas en la tuta cerbo, ne nur por plenumi la altan energian postulon de neŭronoj, sed ankaŭ por renkonti la altan energian postulon de astrocitoj kaj aliaj gliaj ĉeloj (17, 48). Niaj rezultoj subtenas kreskantan evidentecon, ke ŝanĝoj en redox-potencialo kaj interrompo de energiaj vojoj povas esti la kerna ligo inter pluraj ŝlosilaj procezoj implikitaj en la patogenezo de AD, inkluzive de mitokondriaj malordoj, glial-mediata inflamo kaj Vaskula damaĝo (49). Krome, la metabolaj cerbo-spinaj likvaj biomarkoj enhavas grandan nombron da diferencige riĉaj proteinoj inter nia kontrolo kaj AD-similaj AsymAD-subgrupoj, sugestante, ke la interrompo de ĉi tiuj energiaj kaj redox-vojoj povas esti kritika en la antaŭklinika stadio de la malsano.
La malsamaj tendencoj de cerbo- kaj cerbospina fluida panelo, kiujn ni observis, ankaŭ havas interesajn biologiajn implicojn. Sinapsoj kaj metabolomoj riĉaj je neŭronoj montras malkreskintajn nivelojn en la AD-cerbo kaj pliigitan abundon en cerbo-spina likvaĵo. Konsiderante ke neŭronoj estas riĉaj je energi-produktantaj mitokondrioj ĉe sinapsoj por provizi energion por siaj multnombraj specialigitaj signaloj (50), la simileco de la esprimprofiloj de ĉi tiuj du neŭronaj grupoj estas atendita. La perdo de neŭronoj kaj la eltrudo de damaĝitaj ĉeloj povas klarigi ĉi tiujn tendencojn de cerbo kaj CSF-panelo en pli posta malsano, sed ili ne povas klarigi la fruajn panelajn ŝanĝojn, kiujn ni observas (13). Unu ebla klarigo por tiuj trovoj en frua sensimptoma malsano estas nenormala sinapta pritondado. Nova indico en musmodeloj sugestas, ke mikroglia-mediaciita sinapta fagocitozo povas esti nenormale aktivigita en AD kaj konduki al frua sinapsa perdo en la cerbo (51). Ĉi tiu forĵetita sinapta materialo povas akumuliĝi en CSF, tial ni observas la pliiĝon en CSF en la neŭrona panelo. Imun-mediata sinapta pritondado ankaŭ povas parte klarigi la pliiĝon de gliaj proteinoj, kiujn ni observas en la cerbo kaj cerbo-spina likvaĵo dum la malsanproceso. Aldone al sinapta pritondado, totalaj anomalioj en la ekzocita pado ankaŭ povas konduki al malsamaj cerbaj kaj CSF-esprimoj de neŭronaj signoj. Kelkaj studoj montris, ke la enhavo de eksosomoj en la patogenezo de AD-cerbo ŝanĝiĝis (52). La eksterĉela vojo ankaŭ estas implikita en la proliferado de Aβ (53, 54). Indas noti, ke subpremado de eksosoma sekrecio povas redukti AD-similan patologion en AD-transgenaj musmodeloj (55).
Samtempe, la proteino en la vaskula panelo montris moderan pliiĝon en la AD-cerbo, sed signife malpliiĝis en la CSF. La misfunkcio sango-cerba baro (BBB) povas parte klarigi ĉi tiujn trovojn. Multaj sendependaj postmortaj homaj studoj montris BBB-rompon en AD (56, 57). Ĉi tiuj studoj konfirmis diversajn eksternormajn agadojn ĉirkaŭ ĉi tiun firme sigelitan tavolon de endoteliaj ĉeloj, inkluzive de cerba kapilara elfluo kaj perivaskula amasiĝo de sang-portitaj proteinoj (57). Ĉi tio povas disponigi simplan klarigon por la levitaj vaskulaj proteinoj en la cerbo, sed ĝi ne povas plene klarigi la malplenigon de ĉi tiuj samaj proteinoj en la cerbo-spina likvaĵo. Unu ebleco estas, ke la centra nervosistemo aktive izolas ĉi tiujn molekulojn por solvi la problemon de pliigita inflamo kaj oxidativa streso. La redukto de kelkaj el la plej severaj CSF-proteinoj en ĉi tiu panelo, precipe tiuj implikitaj en lipoproteina reguligo, rilatas al la inhibicio de damaĝaj niveloj de inflamo kaj la neŭroprotekta procezo de reaktivaj oksigenaj specioj. Ĉi tio validas por Paroxonase 1 (PON1), lipoproteina enzimo respondeca por reduktado de oxidativa streso en la cirkulado (58, 59). Alfa-1-mikroglobulin/bikunin-antaŭulo (AMBP) estas alia signife malsupren-reguligita signo de la angia grupo. Ĝi estas la antaŭulo de la lipida transportilo bikunino, kiu ankaŭ estas implikita en inflamo-subpremado kaj neŭrologia Protekto (60, 61).
Malgraŭ diversaj interesaj hipotezoj, la malkapablo rekte detekti biokemiajn malsanmekanismojn estas bonkonata limigo de eltrovaĵ-movita proteomika analizo. Tial, plia esplorado estas necesa por memfide difini la mekanismojn malantaŭ ĉi tiuj biomarkaj paneloj. Por antaŭeniri al la disvolviĝo de klinika analizo bazita en MS, la estonta direkto ankaŭ postulas la uzon de celitaj kvantaj metodoj por grandskala kontrolado de biosignoj, kiel selektema aŭ paralela reakcia monitorado (62). Ni lastatempe uzis paralelan reagan monitoradon (63) por validigi multajn el la CSF-proteinaj ŝanĝoj priskribitaj ĉi tie. Pluraj prioritataj panelceloj estas kvantigitaj kun grava precizeco, inkluzive de YWHAZ, ALDOA kaj SMOC1, kiuj mapas al niaj sinapso, metabolo kaj inflamo paneloj, respektive (63). Sendependa Datuma Akiro (DIA) kaj aliaj MS-bazitaj strategioj ankaŭ povas esti utilaj por celkonfirmo. Bud et al. (64) Estis lastatempe pruvite, ke ekzistas signifa interkovro inter la AD-biomarkoj identigitaj en nia CSF-malkovra datumaro kaj la sendependa DIA-MS-datumaro, kiu konsistas el preskaŭ 200 CSF-provaĵoj de tri malsamaj eŭropaj kohortoj. Ĉi tiuj lastatempaj studoj subtenas la potencialon de niaj paneloj transformi en fidindan MS-bazitan detekto. Tradicia antikorpo kaj aptamer-bazita detekto ankaŭ estas grava por la pluevoluigo de esencaj AD-biosignoj. Pro la malalta abundo de CSF, estas pli malfacile detekti tiujn biosignojn uzante alt-produktajn MS-metodojn. NEFL kaj NRGN estas du tiaj ekzemploj de malalt-abundaj CSF-biomarkoj, kiuj estas mapitaj al la panelo en nia ampleksa analizo, sed ne povas esti fidinde detektitaj uzante nian ununuran MS-strategion. Celaj strategioj bazitaj sur multoblaj antikorpoj, kiel ekzemple PEA, povas antaŭenigi la klinikan transformon de ĉi tiuj signoj.
Ĝenerale, ĉi tiu studo disponigas unikan proteomikan aliron por la identigo kaj konfirmo de CSF AD-biosignoj bazitaj sur malsamaj sistemoj. Optimumigo de ĉi tiuj markaj paneloj tra pliaj AD-kohortoj kaj MS-platformoj povas pruvi promesi antaŭenigi AD-riskan tavoliĝon kaj traktadon. Studoj kiuj taksas la longitudan nivelon de ĉi tiuj paneloj laŭlonge de la tempo ankaŭ estas kritikaj por determini kiu kombinaĵo de signoj plej bone tavoligas la riskon de frua malsano kaj ŝanĝoj en malsangraveco.
Krom la 3 specimenoj kopiitaj de CSF, ĉiuj CSF-provaĵoj uzitaj en ĉi tiu studo estis kolektitaj sub la aŭspicioj de Emory ADRC aŭ proksime rilataj esplorinstitucioj. Totalo de kvar aroj de Emory CSF-provaĵoj estis uzita en tiuj proteomikaj studoj. La CSF-kohorto estis trovita enhavi provaĵojn de 20 sanaj kontroloj kaj 20 AD-pacientoj. CSF-kopio 1 inkluzivas specimenojn de 32 sanaj kontroloj, 31 AsymAD-individuoj kaj 33 AD-individuoj. CSF-kopio 2 enhavas 147 kontrolojn kaj 150 AD-specimenojn. La multi-malsana CSF-reproduktado 4 kohorto inkludis 18 kontrolojn, 17 AD, 19 ALS, 13 PD, kaj 11 FTD-specimenojn. Laŭ la interkonsento aprobita de la Institucia Revizia Estraro de la Universitato de Emory, ĉiuj partoprenantoj de la studo de Emory akiris informitan konsenton. Laŭ la National Institute of Aging Best Practice Guidelines for Alzheimer's Centers de 2014 (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), cerbo-spina likvaĵo estis kolektita kaj stokita per lumba trapikiĝo. Kontrolo kaj AsymAD kaj AD-pacientoj ricevis normigitan kognan taksadon ĉe Emory Cognitive Neurology Clinic aŭ Goizueta ADRC. Iliaj specimenoj de cerbo-spina fluido estis provitaj de INNO-BIA AlzBio3 Luminex por ELISA Aβ1-42, totala tau kaj p-tau-analizo (65). ELISA-valoroj estas uzataj por subteni la diagnozan klasifikon de subjektoj surbaze de establitaj kriterioj de detranĉo de biomarkiloj de AD (66, 67). Bazaj demografiaj kaj diagnozaj datenoj por aliaj CSF-diagnozoj (FTD, ALS, kaj PD) ankaŭ estas akiritaj de Emory ADRC aŭ filiigitaj esplorinstitucioj. La resumaj kazmetadatenoj por tiuj Emory CSF-kazoj troveblas en Tabelo S1A. La karakterizaĵoj de la svisa CSF-reproduktado 3-kohorto estis antaŭe publikigitaj (45).
CSF trovis la specimenon. Por pliigi la profundon de nia malkovro de la CSF-datumaro, imuna konsumo de alt-abundaj proteinoj estis farita antaŭ tripsinigo. Mallonge, 130 μl da CSF el 40 individuaj CSF-provaĵoj kaj egala volumeno (130 μl) da High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) estis metitaj en spinkolonon (Thermo Fisher Scientific, A89868) ĉe ĉambro. temperaturo Inkubi). Post turnado dum 15 minutoj, centrifugu la specimenon je 1000 g dum 2 minutoj. 3K ultracentrifuga filtrila aparato (Millipore, UFC500396) estis uzita por koncentri la elfluan provaĵon per centrifugado ĉe 14,000g dum 30 minutoj. Diluu ĉiujn specimenajn volumojn al 75 μl kun fosfata tamponita salo. La proteinkoncentriĝo estis taksita per la metodo de bicinkonina acido (BCA) laŭ la protokolo de la fabrikanto (Thermo Fisher Scientific). La imunomalplenigita CSF (60 μl) de ĉiuj 40 specimenoj estis digestita kun lisilendopeptidase (LysC) kaj tripsino. Mallonge, la specimeno estis reduktita kaj alkilata per 1.2 μl 0.5 M tris-2(-carboxyetil)-fosfino kaj 3 μl 0.8 M kloroacetamide je 90 °C dum 10 minutoj, kaj poste sonikita en akvobano dum 15 minutoj. La specimeno estis diluita per 193 μl 8 M urea bufro [8 M ureo kaj 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] al fina koncentriĝo de 6 M ureo. LysC (4.5 μg; Wako) estas uzita por subita digestado ĉe ĉambra temperaturo. La specimeno tiam estis diluita al 1 M ureo kun 50 mM amonia bikarbonato (ABC) (68). Aldonu egalan kvanton (4,5 μg) de tripsino (Promega), kaj poste kovu la specimenon dum 12 horoj. Acidigu la digestitan peptidan solvon al fina koncentriĝo de 1% formiacido (FA) kaj 0,1% trifluoraceta acido (TFA) (66), kaj poste sensaligi per 50 mg Sep-Pak C18-kolumno (Akvoj) kiel priskribite supre (25) . La peptido tiam estis eluita en 1 ml da 50% acetonitrilo (ACN). Por normigi proteinkvantigon trans aroj (25), 100 μl alikvotoj de ĉiuj 40 CSF-specimenoj estis kombinitaj por generi miksitan provaĵon, kiu tiam estis dividita en kvin tutmondajn internajn normajn (GIS) (48) specimenojn. Ĉiuj individuaj specimenoj kaj kombinitaj normoj estas sekigitaj per altrapida vakuo (Labconco).
CSF kopias la specimenon. Dayon kaj kolegoj antaŭe priskribis imunan malplenigon kaj digeston de CSF-kopio 3-provaĵoj (45, 46). La ceteraj kopiitaj specimenoj ne estis individue imunomalplenigitaj. Digestu ĉi tiujn neforigitajn specimenojn en tripsino kiel priskribite antaŭe (17). Por ĉiu ripeta analizo, 120 μl alikvotoj de la eluita peptido de ĉiu specimeno estis kunigitaj kaj dividitaj en egalajn volumenajn alikvotojn por esti uzataj kiel la TMT-etikedita tutmonda interna normo (48). Ĉiuj individuaj specimenoj kaj kombinitaj normoj estas sekigitaj per altrapida vakuo (Labconco). Por plifortigi la signalon de la malalt-abunda CSF-proteino, kombinante 125 μl de ĉiu specimeno, "plifortigita" provaĵo estis preparita por ĉiu kopia analizo [t.e., biologia provaĵo kiu imitas la esploran provaĵon, sed la disponebla kvanto estas. multe pli granda (37, 69)] kunfandita en miksitan CSF-specimenon (17). La miksita specimeno tiam estis imunforigita uzante 12 ml da High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), digestita kiel priskribite supre, kaj inkluzivita en la posta multobla TMT-etikedado.
Afiŝtempo: Aŭg-27-2021