Dankon pro vizito de Nature.com. La retumila versio, kiun vi uzas, havas limigitan CSS-subtenon. Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruo-Reĝimon en Internet Explorer). Intertempe, por certigi daŭran subtenon, ni redonos la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Termofiloj estas mikroorganismoj kiuj prosperas ĉe altaj temperaturoj. Studi ilin povas doni valorajn informojn pri kiel la vivo adaptiĝas al ekstremaj kondiĉoj. Tamen, estas malfacile atingi alttemperaturajn kondiĉojn per konvenciaj optikaj mikroskopoj. Pluraj memfaritaj solvoj bazitaj sur loka rezistema elektra hejtado estis proponitaj, sed ne ekzistas simpla komerca solvo. En ĉi tiu artikolo, ni enkondukas la koncepton de mikroskala lasera hejtado super la mikroskopa vidkampo por provizi altajn temperaturojn por termofilaj studoj tenante la medion de la uzanto milda. Mikskala hejtado ĉe modera lasera intenseco povas esti atingita uzante oran nanopartiklan kovritan substraton kiel biokongruan kaj efikan lumsorbilon. Eblaj efikoj de mikroskala fluida konvekcio, ĉelreteno, kaj centrifuga termoforetika moviĝo estas diskutitaj. La metodo estis pruvita en du specioj: (i) Geobacillus stearothermophilus, aktiva termofila bakterio kiu reproduktiĝas je ĉirkaŭ 65°C, kiun ni observis ĝermi, kreski kaj naĝi sub mikroskala hejtado; (ii) Thiobacillus sp., optimume hipertermofila arkeo. je 80°C. Ĉi tiu laboro malfermas la vojon por simpla kaj sekura observado de termofilaj mikroorganismoj uzante modernajn kaj atingeblajn mikroskopiolojn.
Dum miliardoj da jaroj, vivo sur la Tero evoluis por adaptiĝi al larĝa gamo de mediaj kondiĉoj, kiuj foje estas konsiderataj ekstremaj el nia homa perspektivo. Precipe iuj termofilaj mikroorganismoj (bakterioj, arĥeoj, fungoj) nomataj termofiloj prosperas en la temperaturo de 45°C ĝis 122°C1, 2, 3, 4. Termofiloj vivas en diversaj ekosistemoj, kiel profundaj hidrotermikaj ellastruoj, termofontoj. aŭ vulkanaj areoj. Ilia esplorado generis multe da intereso dum la lastaj jardekoj pro almenaŭ du kialoj. Unue, ni povas lerni de ili, ekzemple, kiel termofiloj 5, 6, enzimoj 7, 8 kaj membranoj 9 estas stabilaj ĉe tiom altaj temperaturoj, aŭ kiel termofiloj povas elteni ekstremajn nivelojn de radiado10. Due, ili estas la bazo por multaj gravaj bioteknologiaj aplikoj1,11,12 kiel produktado de fuelo13,14,15,16, kemia sintezo (dihidro, alkoholoj, metano, aminoacidoj, ktp.)17, biominado18 kaj termostabilaj biokataliziloj7,11, 13. Aparte, la nuntempe bonkonata polimeraza ĉenreakcio (PCR)19 implikas enzimon (Taq-polimerazo) izolitan de la termofila bakterio Thermus aquaticus, unu el la unuaj termofiloj estantaj malkovritaj.
Tamen, la studo de termofiloj ne estas facila tasko kaj ne povas esti improvizita en iu biologia laboratorio. Aparte, vivantaj termofiloj ne povas esti observitaj en vitro per iu norma lummikroskopo, eĉ kun komerce haveblaj hejtkameroj, kutime taksitaj por temperaturoj tiel malaltaj kiel 40 °C. Ekde la 1990-aj jaroj, nur kelkaj esplorgrupoj dediĉis sin al la enkonduko de alt-temperatura mikroskopio (HTM) sistemoj. En 1994 Glukh et al. La hejtado/malvarmiga ĉambro estis konceptita surbaze de la uzo de Peltier-ĉelo kiu kontrolas la temperaturon de rektangulaj kapilaroj fermitaj por konservi malaerobicon 20 . La aparato povas esti varmigita ĝis 100 °C kun rapideco de 2 °C/s, permesante al la verkintoj studi la motilecon de la hipertermofila bakterio Thermotoga maritima21. En 1999 Horn et al. Tre simila aparato estis evoluigita, daŭre bazita sur la uzo de varmigitaj kapilaroj taŭgaj por komerca mikroskopio por studi ĉeldividon/ligon. Post longa periodo de relativa neaktiveco, la serĉo de efikaj HTM-oj rekomencis en 2012, precipe lige kun serio de artikoloj de la Wirth-grupo kiu uzis aparaton inventitan fare de Horn et al. Antaŭ dek kvin jaroj, la motileco de granda nombro da arkeoj, inkluzive de hipertermofiloj, estis studita ĉe temperaturoj ĝis 100 °C uzante varmigitajn kapilarojn23,24. Ili ankaŭ modifis la originan mikroskopon por atingi pli rapidan hejton (plurajn minutojn anstataŭ 35 minutojn por atingi la fiksitan temperaturon) kaj atingi linearan temperaturgradienton de pli ol 2 cm trans la medio. Tiu temperaturgradienta forma aparato (TGFD) estis uzita por studi la moviĝeblon de multaj termofiloj ene de temperaturgradientoj je biologie rilataj distancoj 24, 25 .
Varmigi fermitajn kapilarojn ne estas la sola maniero observi vivantajn termofilojn. En 2012, Kuwabara et al. Memfaritaj foruzeblaj Pyrex-kameroj sigelitaj per varmorezista gluo (Super X2; Cemedine, Japanio) estis uzitaj. La specimenoj estis metitaj sur komerce havebla travidebla hejtplato (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japanio) kapabla hejti ĝis 110 °C, sed ne origine destinita por biobildigo. La aŭtoroj observis efikan dividon de anaerobaj termofilaj bakterioj (Thermosipho globiformans, duobliganta tempo 24 min) je 65 °C. En 2020, Pulshen et al. Efika hejtado de komercaj metalaj pladoj (AttofluorTM, Thermofisher) estis pruvita per du memfaritaj hejtelementoj: kovrilo kaj scenejo (PCR-maŝin-inspira agordo). Ĉi tiu asocio rezultigas unuforman likvan temperaturon kaj malhelpas vaporiĝon kaj kondensadon ĉe la fundo de la kovrilo. La uzo de O-ringo evitas gasinterŝanĝon kun la medio. Ĉi tiu HTM, nomata Sulfoskopo, estis uzata por bildigi Sulfolobus acidocaldarius je 75°C27.
Rekonita limigo de ĉiuj tiuj sistemoj estis la limigo al la uzo de aerceloj, ajna naftomergado estanta maltaŭga por tia alta temperaturo kaj por bildigo tra> 1-mm dikaj travideblaj provaĵoj. Rekonita limigo de ĉiuj tiuj sistemoj estis la limigo al la uzo de aerceloj, ajna naftomergado estanta maltaŭga por tia alta temperaturo kaj por bildigo tra> 1-mm dikaj travideblaj provaĵoj. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование возование возование востем было ограничение ьку любое иммерсионное погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и зари подходило для зрачные образцы толщиной > 1 мм. Rekonita manko de ĉiuj ĉi tiuj sistemoj estis la limigo al la uzo de aerceloj, ĉar ajna naftomergado ne estis taŭga por tia alta temperaturo kaj por bildigo per travideblaj specimenoj > 1 mm dikaj.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适吘都不适吘都不适堌这濙适合气物镜,毫米厚的透明样品成像。 Rekonita limigo de ĉiuj tiuj sistemoj estas la limigo de uzado de aer-entranita spegulo, ĉar ĉiu naftomergado estas malracia por bildigi travideblajn provaĵojn >1 mm dikaj ĉe tiaj altaj temperaturoj. Общепризнанныы недостатком всех этих систем явsio ружение в масло непригодно для таких высоких температур и 1 з 1 1 1щщщ Sed 1 мм. Rekonita malavantaĝo de ĉiuj ĉi tiuj sistemoj estas la limigita uzo de aerlensoj, ajna oleomergado estas maltaŭga por tiaj altaj temperaturoj kaj bildigo per travideblaj specimenoj > 1 mm dikaj.Pli lastatempe, tiu limigo estis ĉesigita fare de Charles-Orzag et al. 28, kiu evoluigis aparaton kiu ne plu disponigas varmon ĉirkaŭ la sistemo de intereso, sed prefere ene de la kovrilvitro mem, kovrita per maldika travidebla tavolo de rezistilo farita el ITO (india-stana oksido). La kovrilo povas esti varmigita ĝis 75 °C pasante elektran kurenton tra la travidebla tavolo. Tamen la aŭtoro ankaŭ devas varmigi la lenson al la celo, sed ne pli ol 65 °C, por ne damaĝi ĝin.
Tiuj ĉi verkoj montras, ke la disvolviĝo de efika alt-temperatura optika mikroskopio ne estis vaste adoptita, ofte postulas memfaritan ekipaĵon, kaj ofte estas atingita koste de spaca rezolucio, kio estas grava malavantaĝo pro tio, ke termofilaj mikroorganismoj ne estas pli grandaj ol kelkaj. mikrometroj. Reduktita hejtado-volumo estas la ŝlosilo por solvi tri proprajn problemojn de HTM: malbona spaca rezolucio, alta termika inercio kiam la sistemo varmigas, kaj damaĝa hejtado de ĉirkaŭaj elementoj (merga oleo, objektiva lenso... aŭ la manoj de uzanto) ĉe ekstremaj temperaturoj. ).
En ĉi tiu artikolo, ni enkondukas HTM por termofila observado, kiu ne baziĝas sur rezistema hejtado. Anstataŭe, ni atingis lokalizitan hejton ene de limigita regiono de la vidkampo de la mikroskopo per lasera surradiado de lumsorbanta substrato. La temperaturdistribuo estis bildigita per kvanta faza mikroskopio (QPM). La efikeco de tiu metodo estas pruvita fare de Geobacillus stearothermophilus, mova termofila bakterio kiu reproduktiĝas je proksimume 65 °C kaj havas mallongan duobligan tempon (proksimume 20 minutojn), kaj Sulfolobus shibatae, hipertermofilo kiu kreskas optimume je 80 °C ( archaea) ilustri. Normala replika indico kaj naĝado estis observitaj kiel funkcio de temperaturo. Ĉi tiu lasero HTM (LA-HTM) ne estas limigita de la dikeco de la kovrilo aŭ de la naturo de la celo (aero aŭ naftomergado). Ĉi tio permesas uzi ajnan altan rezolucian lenson sur la merkato. Ĝi ankaŭ ne suferas de malrapida hejtado pro termika inercio (atingas tujan hejton sur milisekunda skalo) kaj uzas nur komerce haveblajn komponentojn. La nuraj novaj sekureczorgoj rilatas al la ĉeesto de potencaj laseraj radioj (tipe ĝis 100 mW) ene de la aparato kaj eble tra la okuloj, kiuj postulas protektajn okulvitrojn.
La principo de LA-HTM estas uzi laseron por varmigi la provaĵon loke ene de la vidkampo de la mikroskopo (Fig. 1a). Por fari tion, la specimeno devas esti lumsorbanta. Por uzi akcepteblan laseran potencon (malpli ol 100 mW), ni ne fidis je la sorbado de lumo per la likva medio, sed artefarite pliigis la sorbadon de la specimeno kovrante la substraton per oraj nanopartikloj (Fig. 1c). Varmigi orajn nanopartiklojn kun lumo estas de fundamenta graveco al la kampo de termika plasmoniko, kun atendataj aplikoj en biomedicino, nanokemio aŭ sunlumrikoltado29,30,31. Dum la lastaj jaroj, ni uzis ĉi tiun LA-HTM en pluraj studoj ligitaj al varmoplasmo-aplikoj en fiziko, kemio kaj biologio. La ĉefmalfacilaĵo kun tiu metodo estas en montrado de la fina temperaturprofilo, ĉar la levita temperaturo estas limigita al mikroskala regiono ene de la provaĵo. Ni montris ke temperaturmapado povas esti atingita per la kvar-ondlonga transversa tonda interferometro, simpla, alt-rezolucia, kaj tre sentema metodo de kvanta faza mikroskopio bazita sur la uzo de dudimensiaj difraktokradoj (ankaŭ konataj kiel krucaj kradoj) 33,34,35,36. La fidindeco de ĉi tiu termika mikroskopiotekniko, bazita sur kruca krada ondofronta mikroskopio (CGM), estis pruvita en dekduo da artikoloj publikigitaj dum la pasinta jardeko37,38,39,40,41,42,43.
Skemo de instalado de paralela lasera hejtado, formado kaj temperaturmikroskopo. b Specimena geometrio konsistanta el AttofluorTM kamero enhavanta kovrilon kovritan per oraj nanopartikloj. c Rigardu atente la specimenon (ne skale). d reprezentas la unuforman laserradioprofilon kaj (e) la ŝajnigitan postan temperaturdistribuon sur la provaĵaviadilo de la oraj nanopartikloj. f estas ringoforma lasera radioprofilo taŭga por generi unuforman temperaturon kiel montrite en la simulado de la rezulta temperaturdistribuo montrita en (g). Skalstango: 30 µm.
Aparte, ni lastatempe atingis hejton de mamulaj ĉeloj kun LA-HTM kaj CGM kaj spuris ĉelajn varmoŝokajn respondojn en la intervalo de 37-42 °C, pruvante la aplikeblecon de ĉi tiu tekniko al unuopa vivanta ĉela bildigo. Tamen, la apliko de LA-HTM al la studo de mikroorganismoj ĉe altaj temperaturoj ne estas malambigua, ĉar ĝi postulas pli da singardo kompare kun mamulaj ĉeloj: unue, varmigi la fundon de la medio je dekoj da gradoj (prefere ol kelkaj gradoj) kondukas. al forta vertikala temperaturgradiento. povas krei fluidan konvekcion 44 kiu, se ne firme alkroĉita al la substrato, povas kaŭzi nedezirindajn movadon kaj miksadon de bakterioj. Tiu konvekcio povas esti eliminita reduktante la dikecon de la likva tavolo. Por ĉi tiu celo, en ĉiuj eksperimentoj prezentitaj sube, bakteriaj pendoj estis metitaj inter du kovriloj proksimume 15 µm dikaj metitaj ene de metala taso (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c). Principe, konvekcio povas esti evitita se la dikeco de la likvaĵo estas pli malgranda ol la radiograndeco de la hejta lasero. Due, labori en tia limigita geometrio povas sufoki aerobiajn organismojn (vidu Fig. S2). Ĉi tiu problemo povas esti evitita per uzado de substrato kiu estas penetrebla al oksigeno (aŭ ajna alia esenca gaso), lasante kaptitajn aervezikojn ene de la kovrilo, aŭ per borado de truoj en la supra kovrilo (vidu Fig. S1) 45 . En ĉi tiu studo, ni elektis la lastan solvon (Figuroj 1b kaj S1). Fine, lasera hejtado ne disponigas unuforman temperaturdistribuon. Eĉ ĉe la sama intenseco de la lasera radio (Fig. 1d), la temperaturdistribuo ne estas unuforma, sed prefere similas la gaŭsan distribuon pro termika difuzo (Fig. 1e). Kiam la celo estas establi precizajn temperaturojn en la vidkampo por studi biologiajn sistemojn, malebenaj profiloj ne estas idealaj kaj ankaŭ povas konduki al termoforetika movado de bakterioj se ili ne aliĝas al la substrato (vidu Fig. S3, S4)39. Tiucele, ni uzis spacan lummodulilon (SLM) por formi la infraruĝan laseran radion laŭ la formo de la ringo (Fig. 1f) en la ebeno de la specimeno por atingi perfekte unuforman temperaturdistribuon ene de donita geometria areo, malgraŭ termika disvastigo (Fig. 1d) 39 , 42, 46. Metu supran kovrilon super metala plado (Figuro 1b) por eviti vaporiĝon de la medio kaj observu dum almenaŭ kelkaj tagoj. Ĉar ĉi tiu supra kovrilo ne estas sigelita, kroma medio povas esti facile aldonita iam ajn se necese.
Por ilustri kiel LA-HTM funkcias kaj pruvi ĝian aplikeblecon en termofila esplorado, ni studis la aerobajn bakteriojn Geobacillus stearothermophilus, kiuj havas optimuman kreskotemperaturon de ĉirkaŭ 60-65 °C. La bakterio ankaŭ havas flagelojn kaj la kapablon naĝi, provizante alian indikilon de normala ĉela agado.
Specimenoj (Fig. 1b) estis antaŭ-inkubitaj je 60 °C dum unu horo kaj poste metitaj en LA-HTM-provaĵposedilon. Ĉi tiu antaŭ-inkubacio estas laŭvola, sed ankoraŭ utila, pro du kialoj: Unue, kiam la lasero estas ŝaltita, ĝi igas la ĉelojn tuj kreski kaj dividi (vidu filmon M1 en Suplementaj Materialoj). Sen antaŭ-inkubacio, bakteria kresko estas tipe prokrastita je proksimume 40 minutoj ĉiun fojon kiam nova rigardareo estas varmigita sur la provaĵo. Due, la 1-hora antaŭ-inkubacio antaŭenigis aliĝon de la bakterioj al la kovrilo, malhelpante ĉelojn drivi el la vidkampo pro termoforezo kiam la lasero estis ŝaltita (vidu filmon M2 en Suplementaj Materialoj). Termoforezo estas la movado de partikloj aŭ molekuloj laŭ temperaturgradiento, kutime de varma ĝis malvarma, kaj bakterioj ne estas escepto43,47. Ĉi tiu nedezirinda efiko estas forigita sur antaŭfiksita areo uzante SLM por formi la laseran radion kaj atingi platan temperaturdistribuon.
Sur fig. Figuro 2 montras la temperaturdistribuon mezurita de CGM akirita per surradiado de vitra substrato kovrita per oraj nanopartikloj kun ringa lasera radio (Fig. 1f). Plata temperaturdistribuo estis observita super la tuta areo kovrita per la laserradio. Ĉi tiu zono estis fiksita al 65 °C, la optimuma kreskotemperaturo. Ekster ĉi tiu regiono, la temperaturkurbo nature falas al \(1/r\) (kie \(r\) estas la radiala koordinato).
Temperaturmapo de CGM-mezuradoj akiritaj uzante ringoforman laserradion por surradii tavolon de oraj nanopartikloj por akiri platan temperaturprofilon super cirkla areo. b Izotermo de la temperaturmapo (a). La konturo de la lasera radio estas reprezentita per griza punktita cirklo. La eksperimento estis ripetita dufoje (vidu Suplementajn Materialojn, Figuro S4).
La daŭrigebleco de bakteriaj ĉeloj estis monitorita dum pluraj horoj uzante LA-HTM. Sur fig. 3 montras la tempintervalon por kvar bildoj prenitaj de 3-hora 20-minuta filmo (Filmo M3, Suplementaj Informoj). Bakterioj estis observitaj aktive proliferas ene de la cirkla areo difinita per la lasero kie la temperaturo estis optimuma, alproksimiĝante al 65 °C. En kontrasto, ĉelkresko estis signife reduktita kiam la temperaturo falis sub 50 °C dum 10 s.
Optikaj profundbildoj de G. stearothermophilus bakterioj kreskantaj post lasera hejtado en malsamaj tempoj, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, el 200 Eltirita de unuminuta filmo (M3-filmo disponigita en Suplementaj Informoj) supermetita sur la responda temperaturmapo. La lasero turniĝas je la tempo \(t=0\). Izotermoj estis aldonitaj al la intensecbildo.
Por plue kvantigi ĉelan kreskon kaj ĝian dependecon de temperaturo, ni mezuris la pliiĝon de biomaso de diversaj kolonioj de komence izolitaj bakterioj en la vidkampo de Filmo M3 (Fig. 4). La gepatraj bakterioj elektitaj ĉe la komenco de mini-kolonio formanta unuo (mCFU) estas montritaj en Figuro S6. Sekaj masmezuradoj estis faritaj per CGM 48 fotilo kiu kutimis mapi la temperaturdistribuon. La kapablo de la CGM mezuri sekan pezon kaj temperaturon estas la forto de la LA-HTM. Kiel atendite, alta temperaturo kaŭzis pli rapidan bakterian kreskon (Fig. 4a). Kiel montrite en la duonloga diagramo en Fig. 4b, kresko ĉe ĉiuj temperaturoj sekvas eksponenta kreskon, kie la datenoj uzas la eksponenta funkcio \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), kie \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – tempo de generacio (aŭ tempo de duobligo), \( g =1/ \tau\) – kreskorapideco (nombro de dividoj po unuotempo). Sur fig. 4c montras la respektivan kreskorapidecon kaj generaciotempon kiel funkcion de temperaturo. Rapide kreskantaj mCFU estas karakterizitaj per saturiĝo de kresko post du horoj, atendata konduto pro alta bakteria denseco (simila al la senmova fazo en klasikaj likvaj kulturoj). La ĝenerala formo \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) respondas al la atendata dufaza kurbo por G. stearothermophilus kun optimuma kreskorapideco ĉirkaŭ 60-65°C. Kongruu la datumojn uzante kardinalan modelon (Figuro S5)49 kie \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, kiu bone kongruas kun aliaj valoroj cititaj en la literaturo49. Kvankam la temperaturdependaj parametroj estas reprodukteblaj, la maksimuma kreskorapideco de \({G}_{0}\) povas varii de unu eksperimento al alia (vidu figurojn S7-S9 kaj filmon M4). Kontraste al temperaturkonvenaj parametroj, kiuj devus esti universalaj, la maksimuma kreskorapideco dependas de la trajtoj de la medio (havebleco de nutraĵoj, oksigenkoncentriĝo) ene de la observita mikroskala geometrio.
a Mikroba kresko ĉe diversaj temperaturoj. mCFU: Miniaturaj Colony Forming Units. Datenoj akiritaj de vidbendo de ununura bakterio kreskanta en temperaturgradiento (filmo M3). b Same kiel (a), duonlogaritma skalo. c Kreska indico\(\tau\) kaj generaciotempo\(g\) kalkulita el lineara regreso (b). Horizontalaj erarbrikoj: temperaturintervalo super kiu mCFUoj disetendiĝis en la vidkampon dum kresko. Vertikalaj eraraj stangoj: lineara regresa norma eraro.
Aldone al normala kresko, kelkaj bakterioj foje flosis en vido dum laserhejtado, kio estas atendata konduto por bakterioj kun flageloj. La filmo M5 en pliaj informoj montras tiajn naĝantajn agadojn. En ĉi tiu eksperimento, unuforma lasera radiado estis uzata por krei temperaturgradienton, kiel montrite en Figuroj 1d, e kaj S3. Figuro 5 montras du bildsekvencojn elektitajn el la filmo M5 montrante ke unu bakterio elmontras direktan movon dum ĉiuj aliaj bakterioj restas senmovaj.
La du tempokadroj (a) kaj (b) montras la naĝadon de du malsamaj bakterioj markitaj per punktitaj cirkloj. La bildoj estis ĉerpitaj de la M5-filmo (provizita kiel suplementa materialo).
En la kazo de G. stearothermophilus, la aktiva movado de bakterioj (Fig. 5) komenciĝis kelkajn sekundojn post kiam la lasera radio estis ŝaltita. Ĉi tiu observado emfazas la tempan respondon de tiu termofila mikroorganismo al pliiĝo de temperaturo, kiel jam observite de Mora et al. 24 . La temo de bakteria motileco kaj eĉ termotaksio povas esti plu esploritaj uzante LA-HTM.
Mikroba naĝado ne devus esti konfuzita kun aliaj specoj de fizika moviĝo, nome (i) Brownia moviĝo, kiu ŝajnas esti kaosa moviĝo sen difinita direkto, (ii) konvekcio 50 kaj termoforezo 43, konsistante el regula movo drivo laŭ temperaturo. gradiento.
G. stearothermophilus estas konata pro ĝia kapablo produkti tre rezistemajn sporojn (sporformacio) kiam eksponite al malfavoraj medikondiĉoj kiel defendo. Kiam mediaj kondiĉoj denove iĝas favoraj, la sporoj ĝermas, formante vivantajn ĉelojn kaj rekomencante kreskon. Kvankam ĉi tiu procezo de sporulado/ĝermado estas konata, ĝi neniam estis observita en reala tempo. Uzante LA-HTM, ni raportas ĉi tie la unuan observadon de ĝermadokazaĵoj en G. stearothermophilus.
Sur fig. 6a montras temp-rapidajn bildojn de optika profundo (OT) akirita uzante CGM-aron de 13 sporoj. Dum la tuta kolekta tempo (15 h 6 min, \(t=0\) – la komenco de lasera hejtado), 4 el 13 sporoj ĝermis, en sinsekvaj tempopunktoj \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' kaj \(11\) h \(30\)'. Kvankam nur unu el ĉi tiuj eventoj estas montrita en Figuro 6, 4 ĝermaj eventoj povas esti observitaj en la filmo M6 en la suplementa materialo. Interese, ke ĝermado ŝajnas hazarda: ne ĉiuj sporoj ĝermas kaj ne ĝermas samtempe, malgraŭ la samaj ŝanĝoj en mediaj kondiĉoj.
Time-lapse konsistanta el 8 OT-bildoj (oleomergado, 60x, 1.25 NA celo) kaj (b) biomasevoluo de G. stearothermophilus agregaĵoj. c (b) Desegnite sur duon-loga skalo por reliefigi la linearecon de la kreskorapideco (streklinio).
Sur fig. 6b,c montras la biomason de ĉelpopulacioj en la vidkampo kiel funkcio de tempo dum la tuta periodo de datenkolektado. La rapida disfalo de la seka maso observita ĉe \(t=5\)h en fig. 6b, c, pro la eliro de kelkaj ĉeloj el la vidkampo. La kreskorapideco de ĉi tiuj kvar eventoj estas \(0.77\pm 0.1\) h-1. Ĉi tiu valoro estas pli alta ol la kreskorapideco asociita kun Figuro 3. 3 kaj 4, kie ĉeloj kreskas normale. La kialo de la pliigita kreskorapideco de G. stearothermophilus de sporoj estas neklara, sed tiuj mezuradoj elstarigas la intereson de LA-HTM kaj funkcias ĉe la unuĉela nivelo (aŭ ĉe la ununura mCFU-nivelo) por lerni pli pri la dinamiko de ĉelvivo. .
Por plue pruvi la ĉiuflankecon de LA-HTM kaj ĝian agadon ĉe altaj temperaturoj, ni ekzamenis la kreskon de Sulfolobus shibatae, hipertermofila acidofila arkeo kun optimuma kreskotemperaturo de 80 °C51. Kompare kun G. stearothermophilus, tiuj arkeoj ankaŭ havas tre malsaman morfologion, simila al 1 mikronaj sferoj (kokoj) prefere ol longformaj bastonoj (baciloj).
Figuro 7a konsistas el sinsekvaj optikaj profundaj bildoj de S. shibatae mCFU akirita per CGM (vidu M7-plenlongan filmon en Suplementaj Materialoj). Tiu mCFU kreskas je proksimume 73 °C, sub la optimuma temperaturo de 80 °C, sed ene de la temperaturintervalo por aktiva kresko. Ni observis multoblajn fisiajn eventojn, kiuj igis mCFU-ojn aspekti kiel mikrovinberoj de arkeoj post kelkaj horoj. De ĉi tiuj OT-bildoj, mCFU-biomaso estis mezurita laŭlonge de la tempo kaj prezentita en Figuro 7b. Interese, S. shibatae mCFUs montris linearan kreskon prefere ol la eksponenta kresko vidita kun G. stearothermophilus mCFUs. Okazis delonga diskuto 52 pri la naturo de ĉelaj kreskorapidecoj: dum kelkaj studoj raportas kreskorapidecojn de mikroboj kiuj estas proporciaj al ilia grandeco (eksponenta kresko), aliaj montras konstantan indicon (linia aŭ dulineara kresko). Kiel klarigite fare de Tzur et al.53, distingi inter eksponenta kaj (bi)linia kresko postulas precizecon de <6% en biomasmezuradoj, kio estas ekstere de atingo por la plej multaj QPM-teknikoj, eĉ implikante interferometrion. Kiel klarigite fare de Tzur et al.53, distingi inter eksponenta kaj (bi)linia kresko postulas precizecon de <6% en biomasmezuradoj, kio estas ekstere de atingo por la plej multaj QPM-teknikoj, eĉ implikante interferometrion. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста третого роста третон 6% х биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерфериромерфе. Kiel klarigite de Zur et al.53, distingi inter eksponenta kaj (bi)linia kresko postulas <6% precizecon en biomasmezuradoj, kio estas neatingebla por la plej multaj QPM-metodoj, eĉ uzante interferometrion.Kiel klarigite de Zur et al. 53, distingi inter eksponenta kaj (bi)linia kresko postulas malpli ol 6% precizecon en biomasmezuradoj, kio estas neatingebla por la plej multaj QPM-metodoj, eĉ kiam interferometrio estas uzita. CGM atingas ĉi tiun precizecon kun sub-pg precizeco en biomasmezuradoj36,48.
Time-lapse konsistanta el 6 OT-bildoj (oleomergado, 60x, NA celo 1.25) kaj (b) mikro-CFU-biomasevoluo mezurita kun CGM. Vidu filmon M7 por pliaj informoj.
La tute linia kresko de S. shibatae estis neatendita kaj ankoraŭ ne estis raportita. Tamen, eksponenta kresko estas atendata, almenaŭ ĉar kun la tempo, multoblaj dividoj de 2, 4, 8, 16 ... ĉeloj devas okazi. Ni hipotezis, ke linia kresko eble ŝuldiĝas al ĉela inhibicio pro densa ĉelpakado, same kiel ĉelkresko malrapidiĝas kaj finfine atingas dormantan staton kiam ĉela denseco estas tro alta.
Ni finas diskutante la sekvajn kvin punktojn de intereso en victurno: redukto en hejtado volumeno, redukto en termika inercio, intereso en oraj nanopartikloj, intereso en kvanta faza mikroskopio, kaj ebla temperaturo gamo en kiu LA-HTM povas esti uzata.
Kompare al rezista hejtado, lasera hejtado uzata por HTM-evoluo ofertas plurajn avantaĝojn, kiujn ni ilustras en ĉi tiu studo. Aparte, en likva amaskomunikilaro en la vidkampo de la mikroskopo, la hejtado-volumo estas konservita ene de kelkaj (10 μm) 3 volumoj. Tiamaniere, nur la observitaj mikroboj estas aktivaj, dum aliaj bakterioj estas neaktivaj kaj povas esti uzataj por plue studi la specimenon - ne necesas ŝanĝi la specimenon ĉiufoje kiam nova temperaturo devas esti kontrolita. Krome, mikroskala hejtado permesas rektan ekzamenon de granda gamo da temperaturoj: Figuro 4c estis akirita de 3-hora filmo (Filmo M3), kiu kutime postulas la preparadon kaj ekzamenon de pluraj specimenoj - unu por ĉiu el la studataj specimenoj. y estas la temperaturo reprezentanta la nombron da tagoj en la eksperimento. Redukti la varmigitan volumon ankaŭ konservas ĉiujn ĉirkaŭajn optigajn komponantojn de la mikroskopo, precipe la objektivan lenson, ĉe ĉambra temperaturo, kio estis grava problemo alfrontita de la komunumo ĝis nun. LA-HTM povas esti uzata kun ajna lenso, inkluzive de oleaj mergaj lensoj, kaj restos ĉe ĉambra temperaturo eĉ kun ekstremaj temperaturoj en la vidkampo. La ĉefa limigo de la lasera hejtado-metodo, kiun ni raportas en ĉi tiu studo, estas, ke ĉeloj, kiuj ne aliĝas aŭ ne flosas, povas esti malproksimaj de la vidkampo kaj malfacile studi. Solvo povus esti uzi malaltajn pligrandigajn lensojn por atingi pli grandan temperaturaltiĝon pli ol kelkaj cent mikronoj. Ĉi tiu singardo estas akompanata de malkresko de spaca rezolucio, sed se la celo estas studi la movadon de mikroorganismoj, alta spaca rezolucio ne estas postulata.
La temposkalo por varmigi (kaj malvarmigi) la sistemon \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) dependas de ĝia grandeco, laŭ la leĝo \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), kie \ (L\ ) estas la karakteriza grandeco de la varmofonto (la diametro de la lasera radio en nia studo estas \(L\ proksimume 100\) μm), \(D\) estas la termika difuzeco de la medio (averaĝe en nia kazo, glaso kaj akvo Disvastigo-rapideco\(D\ proksimume 2\fold {10}^{-7}\) m2/s Tial, en ĉi tiu studo, tempaj respondoj de la ordo de 50 ms, t.e., kvazaŭ tujaj). temperaturŝanĝoj, povas esti atenditaj Ĉi tiu tuja establado de temperaturaltiĝo ne nur mallongigas la daŭron de la eksperimento, sed ankaŭ permesas precizan tempigon \(t=0\) por iu dinamika studo de temperefektoj.
Nia proponita metodo estas aplikebla al iu ajn lumsorbanta substrato (ekzemple, komercaj specimenoj kun ITO-tegaĵo). Tamen, oraj nanopartikloj povas disponigi altan sorbadon en la infraruĝa kaj malaltan sorbadon en la videbla intervalo, ĉi-lastaj karakterizaĵoj de kiuj estas de intereso por efika optika observado en la videbla intervalo, precipe dum uzado de fluoreskeco. Krome, oro estas biokongrua, kemie inerta, optika denseco alĝustigeblas de 530 nm ĝis proksima infraruĝo, kaj specimena preparado estas simpla kaj ekonomia29.
Transversa krada ondofrontmikroskopio (CGM) permesas ne nur temperaturmapadon ĉe la mikroskalo, sed ankaŭ biomasmonitoradon, igante ĝin precipe utila (se ne necese) en kombinaĵo kun LA-HTM. Dum la pasinta jardeko, aliaj temperaturmikroskopioteknikoj estis evoluigitaj, precipe en la kampo de biobildigo, kaj la plej multaj el ili postulas la uzon de temperatur-sentemaj fluoreskaj sondiloj54,55. Tamen, tiuj metodoj estis kritikitaj kaj kelkaj raportoj mezuris nerealismajn temperaturŝanĝojn ene de ĉeloj, eventuale pro la fakto ke fluoreskeco dependas de multaj faktoroj krom temperaturo. Krome, la plej multaj fluoreskaj enketoj estas malstabilaj ĉe altaj temperaturoj. Tial, QPM kaj aparte CGM reprezentas idealan temperaturmikroskopioteknikon por studado de vivo ĉe altaj temperaturoj uzante optikan mikroskopion.
Studoj de S. shibatae, kiuj vivas optimume je 80 °C, montras ke LA-HTM povas esti aplikita por studi hipertermofilojn, ne nur simplajn termofilojn. Principe, ne estas limo al la gamo de temperaturoj atingeblaj per LA-HTM, kaj eĉ temperaturoj super 100 °C povas esti atingitaj ĉe atmosfera premo sen bolado, kiel pruvas nia grupo de 38 en hidrotermika kemiaj aplikoj ĉe atmosfera. premo A. Lasero estas uzata por varmigi orajn nanopartiklojn 40 sammaniere. Tiel, LA-HTM havas la potencialon esti uzita por observi senprecedencajn hipertermofilojn kun norma alta rezolucia optika mikroskopio sub normaj kondiĉoj (te sub media streso).
Ĉiuj eksperimentoj estis faritaj per memfarita mikroskopo, inkluzive de Köhler-lumigado (kun LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), specimeno kun mana xy-movado, celoj (Olimpo, 60x, 0.7 NA, aero, LUCPlanFLN60X aŭ 60x, 1.25 NA, Oleo). , UPLFLN60XOI), CGM-fotilo (QLSI-kruca krado, 39 µm tonalto, 0.87 mm de Andor Zyla fotilsensilo) por disponigi intensecon kaj ondfrontan bildigon, kaj sCMOS-fotilon (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bita reĝimo, de Hamamatsu) por registri la datumoj montritaj en Figuro 5 (bakteria naĝado). La dikroika radiodividilo estas 749 nm BrightLine-rando (Semrock, FF749-SDi01). La filtrilo sur la fronto de la fotilo estas 694 mallonga enirpermesila filtrilo (FF02-694/SP-25, Semrock). Titana safira lasero (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pumpita cunama laserkavaĵo, Spectra-Physics en Fig. 2-5, plu anstataŭigita per Millenia lasero, Spectraphysics 10 W, pumpita Mira laserkavaĵo, Kohera, por Fig. 2 -5). 6 kaj 7) estas fiksitaj al la ondolongo \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, kiu egalrilatas al la plasmona resonanca spektro de oraj nanopartikloj. Spacaj lummodulatoroj (1920 × 1152 pikseloj) estis aĉetitaj de Meadowlark Optics La hologramoj estis kalkulitaj per la Gerchberg-Saxton-algoritmo kiel priskribite en la ligo.
Kruckrad-ondfronta mikroskopio (CGM) estas optika mikroskopiotekniko bazita sur kombinado de dudimensia difrakta krado (ankaŭ konata kiel kruca krado) je distanco de unu milimetro de la sensilo de konvencia fotilo. La plej ofta ekzemplo de CGM kiun ni uzis en ĉi tiu studo estas nomita kvar-ondlonga transversa ŝanĝa interferometro (QLSI), kie la kruc-kradado konsistas el intenseco/faza damtabulpadrono lanĉita kaj patentita fare de Primot et al. en 200034. La vertikalaj kaj horizontalaj kradlinioj kreas krad-similajn ombrojn sur la sensilo, kies misprezento povas esti nombre prilaborita en reala tempo por akiri la optikan ondfrontmisprezenton (aŭ ekvivalentan fazprofilon) de la okazaĵa lumo. Se uzata sur mikroskopo, CGM-fotilo povas montri la optikan paddiferencon de bildaĵo, ankaŭ konata kiel optika profundo (OT), kun sentemo sur la ordo de nanometroj36. En iu CGM-mezurado, por elimini iujn ajn difektojn en la optikaj komponentoj aŭ traboj, primara referenca OT-bildo devas esti prenita kaj subtrahita de iuj postaj bildoj.
Temperatura mikroskopio estis farita per CGM-fotilo kiel priskribite en la referenco. 32. Mallonge, varmigi likvaĵon ŝanĝas ĝian refraktan indicon, kreante termikan lensan efikon, kiu distordas la okazantan trabon. Tiu ondofrontmisprezento estas mezurita fare de la CGM kaj prilaborita uzante dekonvolucian algoritmon por akiri tridimensian temperaturdistribuon en la likva medio. Se la oraj nanopartikloj estas egale distribuitaj tra la specimeno, temperaturamapado povas esti farita en bakteri-liberaj lokoj por produkti pli bonajn bildojn, kion ni foje faras. La referenca CGM-bildo estis akirita sen hejtado (kun la lasero for) kaj poste kaptita ĉe la sama loko en la bildo kun la lasero ŝaltita.
Seka amasmezurado estas atingita per la sama CGM-fotilo uzita por temperaturbildigo. CGM-referencobildoj estis akiritaj rapide movante la provaĵon en x kaj y dum eksponiĝo kiel rimedo de averaĝi ajnan malhomogenecon en la OT pro la ĉeesto de bakterioj. De OT-bildoj de bakterioj, ilia biomaso estis akirita uzante ensemblon de bildoj super areoj elektitaj uzante la memfaritan segmentigalgoritmon de Matlab (vidu subsekcion "Nombra kodo"), sekvante la proceduron priskribitan en ref. 48. Resume, ni uzas la rilaton \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), kie \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) estas la optika profundbildo, \(m\) estas la seka pezo kaj \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) estas konstanto. Ni elektis \({{{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg, kiu estas tipa konstanto por vivantaj ĉeloj.
Kovbildo 25 mm en diametro kaj 150 µm dika kovrita per oraj nanopartikloj estis metita en AttofluorTM kameron (Thermofisher) kun la oraj nanopartikloj alfrontante supren. Geobacillus stearothermophilus estis antaŭkulturita dum la nokto en LB-medio (200 rpm, 60 °C) antaŭ ĉiu tago de eksperimentoj. Guto de 5 µl de suspendo de G. stearothermophilus kun optika denseco (OD) de 0,3 ĝis 0,5 estis metita sur kovrilon kun oraj nanopartikloj. Tiam, ronda kovrilo 18 mm en diametro kun truo 5 mm en diametro en la centro estis faligita sur la guton, kaj 5 μl da bakteria suspendo kun la sama optika denseco estis plurfoje aplikitaj al la centro de la truo. La putoj sur kovriloj estis preparitaj laŭ la procedo priskribita en ref. 45 (vidu Suplementajn Informojn por pliaj informoj). Poste aldonu 1 ml da LB-medio al la kovrilo por malhelpi la likvan tavolon sekiĝi. La lasta kovrilo estas metita super la fermita kovrilo de la ĉambro Attofluor™ por malhelpi vaporiĝon de la medio dum kovado. Por ĝermado-eksperimentoj, ni uzis sporojn, kiuj, post konvenciaj eksperimentoj, foje kovris la supran kovrilon. Simila metodo estis uzita por akiri Sulfolobus shibatae. Tri tagoj (200 rpm, 75 °C) de prepara kultivado de Thiobacillus serrata estis efektivigitaj en medio 182 (DSMZ).
Provaĵoj de oraj nanopartikloj estis preparitaj per micelara blokkopolimerlitografio. Ĉi tiu procezo estas detale priskribita en Ĉap. 60. Mallonge, miĉeloj enkapsulantaj orajn jonojn estis sintezitaj per miksado de la kopolimero kun HAuCl4 en tolueno. La purigitaj kovriloj estis tiam mergitaj en la solvo kaj traktitaj per UV-surradiado en la ĉeesto de reduktanta agento por akiri orajn semojn. Finfine, orsemoj estis kultivitaj kontaktante kovrilon kun akva solvaĵo de KAuCl4 kaj etanolamino dum 16 minutoj, kio rezultigis kvazaŭ-periodan kaj tre unuforman aranĝon de ne-sferaj oraj nanopartikloj en la proksima infraruĝo.
Por konverti la interferogramojn al OT-bildoj, ni uzis memfaritan algoritmon, kiel detale en la ligilo. 33 kaj haveblas kiel Matlab-pakaĵo en la sekva publika deponejo: https://github.com/baffou/CGMprocess. La pakaĵo povas kalkuli intensecon kaj OT-bildojn bazitajn sur registritaj interferogramoj (inkluzive de referencbildoj) kaj fotilaj tabelaj distancoj.
Por kalkuli la fazan ŝablonon aplikitan al SLM por akiri difinitan temperaturprofilon, ni uzis antaŭe evoluigitan memfaritan algoritmon39,42 kiu estas havebla en la sekva publika deponejo: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. La enigo estas la dezirata temperaturkampo, kiu povas esti agordita ciferece aŭ per monokromata bmp-bildo.
Por segmenti la ĉelojn kaj mezuri ilian sekan pezon, ni uzis nian Matlab-algoritmon publikigitan en la sekva publika deponejo: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Sur ĉiu bildo, la uzanto devas alklaki la bakteriojn aŭ mCFU de intereso, ĝustigi la vergon-sentemon kaj konfirmi la elekton.
Por pliaj informoj pri studdezajno, vidu la abstraktaĵon pri Natura Esplora Raporto ligita al ĉi tiu artikolo.
Datumoj subtenantaj la rezultojn de ĉi tiu studo estas haveblaj de la respektivaj aŭtoroj laŭ akceptebla peto.
La fontkodo uzata en ĉi tiu studo estas detala en la sekcio Metodoj, kaj sencimigaj versioj povas esti elŝutitaj de https://github.com/baffou/ en la sekvaj deponejoj: SLM_temperatureShaping, CGMprocess kaj CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R. , Singhal, P. , Singh, H. , Damle, D. & Sharma, AK Kompromo pri termofiloj kaj iliaj larĝaj spektraj aplikoj. Mehta, R. , Singhal, P. , Singh, H. , Damle, D. & Sharma, AK Kompromo pri termofiloj kaj iliaj larĝaj spektraj aplikoj.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. kaj Sharma, AK Superrigardo de termofiloj kaj ilia larĝa apliko. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. kaj Sharma AK Profunda kompreno de termofiloj kaj larĝa gamo de aplikoj.3 Bioteknologio 6, 81 (2016).
Afiŝtempo: Sep-26-2022